復方當歸注射液對缺血性腦損傷大鼠BDNF表達的影響

湯軼波，袁偉暢，朱春燕，張　賽，張　瑋，張林朋，南一楠，牟天龍，王　旭，楊曉敏，何雪飛，潘彥舒

(北京中醫藥大學基礎醫學院病理學系，北京100029)

復方當歸注射液對缺血性腦損傷大鼠BDNF表達的影響

湯軼波，袁偉暢，朱春燕，張賽，張瑋，張林朋，南一楠，牟天龍，王旭，楊曉敏，何雪飛，潘彥舒

(北京中醫藥大學基礎醫學院病理學系，北京100029)

目的：觀察復方當歸注射液(CAI)對局灶性腦缺血損傷模型大鼠患側腦組織及血清中腦源性神經營養因子(BDNF)表達水平的影響，探討CAI對腦缺血損傷的作用機制。方法：50只SD大鼠隨機分為假手術組(10只)和局灶性腦缺血損傷組(40只)。局灶性腦缺血損傷組采用線栓法復制大鼠局灶性腦缺血損傷模型，將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、CAI組和陽性對照依達拉奉組，每組10只。造模大鼠蘇醒后進行神經功能評分，7 d后取材，HE染色檢測大鼠腦組織的病理學改變，測定大鼠血清及缺血側腦組織中BDNF的表達水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分增加(P<0.05)，大鼠神經細胞出現腫脹、壞死和細胞間質水腫等改變，缺血側腦組織及血清中BDNF表達水平有一定的上升趨勢；CAI組大鼠缺血側腦組織BDNF表達水平顯著升高(P<0.05)，血清BDNF表達水平有所升高。與模型組比較，CAI組大鼠神經功能評分降低，大鼠神經細胞輕微水腫，缺血側腦組織及血清BDNF表達水平有所升高。結論：CAI可能具有提高腦內BDNF表達的作用，其作用機制可能與機體在缺血損傷情況下腦內相應的神經因子做出應激反應有關。

復方當歸注射液；局灶性腦缺血；腦源性神經營養因子；疾病模型，動物

復方當歸注射液(Compound Angelica Injection,CAI)是一種中藥方劑，主要由當歸、川穹和紅花等中藥精制而成[1]。具有活血通經和祛瘀止痛的功效。近年來，該藥劑被廣泛應用于哮喘、疼痛、高脂血癥以及部分婦科疾病等的臨床治療，收效顯著[2-4]。已有研究[5]證實：復方當歸注射液改善缺血缺氧性損傷具有顯著作用，但有關其在缺血性腦損傷中作用的研究尚少。本課題組前期研究[6]發現：CAI能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經行為學功能，并減小大鼠的腦梗死體積。本研究探討復方當歸注射液對大鼠局灶性腦缺血損傷后患側腦組織勻漿及血清腦源性神經營養因子(brain dervied neurotrophic factor,BDNF)表達的影響，闡明CAI發揮神經保護作用的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、藥物、主要試劑和儀器健康清潔級雄性SD大鼠50只，體質量250～270 g，購于北京維通利華實驗動物公司，動物許可證編號：SCXK(京)2012-0001。CAI購自福建古田藥業有限公司，批號1304062；依達拉奉注射液購自南京先聲東元制藥有限公司，批號80-130404；水合氯醛購自美國Sigma公司；BCA檢測試劑購自碧云天生物技術有限公司；BDNF ELISA KIT(CYT306)購自美國Millipore公司。SXP-1B型手術顯微鏡(上海醫用光學儀器廠)，1411型高頻小電刀(上海醫療器械技術公司)。

1.2動物分組和給藥50只SD大鼠適應性飼養3 d，室溫22～25℃， 濕度40%～60%。將大鼠隨機分為假手術組(10只)和局灶性腦缺血損傷組(40只)。局灶性腦缺血損傷組大鼠采用線栓法復制大鼠局灶性大腦中動脈缺血(MCAO)模型，將模型復制成功的30只大鼠隨機分為模型組、CAI組和陽性對照依達拉奉組，每組10只。造模1 h后，CAI組給予1 mL·100 g-1CAI腹腔注射，每日2次(合生藥0.2 g·100 g-1·d-1)，給藥劑量參考文獻[7]；陽性藥物組給予0.3 mL·100 g-1依達拉奉注射液腹腔注射，假手術組和模型組給予注射用生理鹽水0.3 mL·100 g-1腹腔注射，均每天給藥1次。

1.3大鼠局灶性腦缺血損傷動物模型的建立根據Longa等[8]報道的線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型：以10%水合氯醛溶液(0.4 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。麻醉后將大鼠仰位固定，頸部正中切口，暴露左側頸動脈三角，逐層分離組織，依次分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。分離ECA的分支甲狀腺動脈，并電刀凝閉；分離頸外與頸內動脈之間的枕動脈，電刀凝閉。結扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動脈(PPA)，用無損動脈夾分別夾閉CCA、ICA和PPA，用虹膜剪在ECA殘端剪一楔形小口，由此插入釣魚線(直徑約0.25 mm，頭端加熱呈直徑約0.3 mm的圓球形)，輕推釣魚線使之由頸外動脈通過分叉部進入頸內動脈，至大腦中動脈的起點，阻斷大腦中動脈的血液供應，縫合頸部切口。假手術組手術過程與模型組相同，分離出左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，但僅結扎頸外動脈。

1.4大鼠神經功能評分造模大鼠蘇醒后進行神經功能評分。評分標準參照Longa的5級評分方法評定動物的神經系統功能[8]。無神經功能障礙記為0分，輕度神經功能缺陷(左前肢伸展運動障礙等)記為1分，中度神經功能缺陷(向左側轉圈)記為2分，嚴重神經功能缺陷(向左側傾倒)記為3分，不能行走及意識水平降低記為4分。評分為1～3分者視為造模成功，納入實驗。造模7 d后再次對各組大鼠進行神經功能評分。

1.5大鼠血清和缺血側腦組織勻漿中BDNF表達水平檢測實驗結束后，每組動物麻醉、腹主動脈取血后斷頭處死，迅速取出全腦，分離出左側(患側)半球，制成10% 腦組織勻漿，以BCA法測定各蛋白樣本濃度后待測。全血靜置離心、分離血清后待測。用ELISA試劑盒測定血清及腦組織勻漿中BDNF表達水平。

1.6大鼠腦組織病理學檢查實驗結束后，每組動物麻醉，以肝素經主動脈弓灌注沖洗，滴注含10%甲醛的磷酸緩沖液灌注固定。取大鼠患者腦組織，用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，而后使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，HE染色，顯微鏡下觀察腦組織的病理學變化。

2　結　果

2.1大鼠神經功能評分假手術組大鼠神經功能未見異常(0分)。與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分顯著升高(P<0.05)，大鼠出現神經功能障礙；與模型組比較，CAI和陽性對照組大鼠神經功能評分均出現不同程度的下降(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血清中BDNF表達水平與假手術組比較，CAI 組和陽性對照組大鼠血清 BDNF表達水平升高，但差異均無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，CAI 組血清 BDNF表達水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠患側腦組織勻漿中BDNF表達水平與假手術組比較，模型組大鼠腦組織 BDNF表達水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；CAI組腦組織勻漿中BDNF表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；陽性對照組腦組織勻漿中BDNF 表達水平也有不同程度的升高(P>0.05)。與模型組比較，CAI 組腦組織 BDNF表達水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠神經功能評分及血清和腦組織中BDNF水平

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

2.4大鼠腦組織病理學改變假手術組大鼠腦組織神經細胞排列有序，形態正常，組織結構清晰完整，細胞膜清晰完整，核仁清晰可見，無水腫及炎性細胞浸潤。模型組大鼠腦組織細胞排列紊亂，可見大量細胞變性、壞死，胞漿空化，核仁消失，細胞水腫。CAI及陽性對照組大鼠腦組織病理改變減輕，細胞排列較紊亂，胞核模糊或不可見，可見細胞變性、壞死，細胞水腫情況有所減輕。見圖1(插頁一)。

3　討　論

在缺血缺氧誘導的腦損傷中，神經營養因子能發揮明確的神經保護作用，如BDNF和胰島素樣生長因子1(insuline like growth factor-1, IGF-1)等在腦內廣泛存在的因子，對各種原因造成的腦損傷均有積極的神經保護作用[9-12]。

隨著人們對中醫藥研究的逐步深入，中醫藥在治療缺血性腦損傷方面的研究取得了巨大的進展，如黃芪總苷(AST)和葛根素等在內的中藥成分，在缺血性腦損傷中能發揮顯著的保護作用，并且這種保護作用與其提高腦內的神經營養因子，特別是BDNF的表達存在相關性[13-17]。本課題組前期研究[6]發現：CAI能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經行為學功能，減小大鼠的腦梗死體積。本實驗作為前期研究工作的深入，進一步探討復方當歸注射液對患側腦組織及血清中BDNF的表達是否有一定的干預作用。

本研究分析大鼠患側腦組織勻漿中BDNF表達水平發現：相對于假手術組，模型組、CAI組和陽性對照組的BDNF表達水平均有升高的趨勢，而CAI組BDNF表達水平升高有統計學意義。這個結果提示在缺血損傷發生后，機體可能會做出應激反應，腦內相應的神經因子的表達出現上調。大鼠血清中BDNF表達水平變化結果顯示：假手術組動物血清中BDNF水平最低，其他3組BDNF水平均有一定升高趨勢，而以CAI組的絕對值最高。

綜合血清和患側腦組織勻漿中BDNF的變化規律，本文作者發現：實現MCAO造模后的3個組別大鼠的BDNF水平均出現了升高趨勢，尤以CAI組的數據絕對值為最高，這個結果提示CAI可能具有增加BDNF表達的作用。但在進行統計學分析處理時，幾個組間多未出現統計學差異，僅假手術組和CAI組大鼠患側腦組織勻漿中的數據比較差異有統計學意義。出現這種情況的原因可能是：①樣本量。本實驗中指標檢測方法為ELISA，樣本量為每組6～9只實驗動物，樣本量相對偏小；檢測數據整體離散度大，數據標準差大，對統計學分析有一定的影響。②BDNF在腦內的表達部位。文獻[18-19]報道：BDNF的表達部位較集中在梗死區邊緣的皮質區、海馬區及半暗帶表達較密集。如果以免疫組織化學的方法在陽性顆粒表達密集的部位進行組間比較，更容易找出組間的差異性。但以ELISA法將整個患側半球進行勻漿后檢測，這種差異性會被弱化，增大樣本量可以提高結果的科學性。③檢測時間點的選擇。腦缺血后BDNF表達水平有一定的時相性，本實驗選擇缺血7 d，時間點單一，如果增加檢測的時間點，得到缺血后BDNF表達變化的連續性的數據對闡明CAI的干預規律將更有意義。

綜上所述，CAI對缺血性腦損傷大鼠的BDNF表達水平可能具有一定的作用，這個結果需要更大樣本量的實驗來驗證。

[1]王達,柳志文,章樂怡,等. 復方當歸注射液對肌成纖維細胞增殖和凋亡影響的研究[J]. 中南藥學,2014, 12(8):775-778.

[2]邱超,郄增旺,程鳳寬,等. 復方當歸注射液穴位注射配合刺絡法治療慢阻肺臨床療效及肺循環功能的觀察[J]. 河北中醫藥學報,2011,26(1):25-26,37.

[3]王琛,姚永琴. 阿是穴注射復方當歸注射液治療宮頸糜爛46例[J]. 社區醫學雜志,2011,9(19):50-51.

[4]王玉石,高巧云,張正標,等. 早期局部注射糖皮質激素及復方當歸注射液預防老年帶狀皰疹后遺神經痛的療效分析[J].中西醫結合心血管病雜志,2015,3(9):117-118.

[5]冉亞軍,陳繼紅. 復方當歸注射液對 H2O2所致心肌細胞凋亡的保護作用[J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 2012,18(8):845-846.

[6]湯軼波,朱春燕,袁偉暢,等. 復方當歸注射液對大鼠缺血性腦損傷模型的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2015,22(2):68-70.

[7]錢海兵,黃勇其,紀剛. 復方當歸注射液對腦缺血再灌注大鼠腦保護作用及對內皮素-1、白介素-6 影響的實驗研究[J]. 貴陽中醫學院學報,2012,34(5):233-236.

[8]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reverible middle cerebral artery occlusion without cranjectomy in rats [J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[9]Lin S, Rhodes PG, Cai Z, et al. Whole body hypothermia broadens the therapeutic window of intranasally administered IGF-1 in a neonatal rat model of cerebral hypoxia-ischemia [J]. Brain Res, 2011,1385:246-256.

[10]Xia Y, Wang CZ, Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor prevents phencyclidine-induced apoptosis in developing brain by parallel activation of both the ERK and PI-3K/Akt pathways[J]. Neuropharmacology, 2010,58(2):330-336.

[11]Larpthaveesarp A, Ferriero DM, Gonzalez FF. Growth factors for the treatment of ischemic brain injury (growth factor treatment) [J]. Brain Sci, 2015,5(2):165-177.

[12]Wang J, Tang Y, Zhang W, et al. Insulin-like growth factor-1 secreted by brain microvascular endothelial cells attenuates neuron injury upon ischemia [J]. FEBS J, 2013,280(15):3658-3668.

[13]尹艷艷,李衛平,李維祖,等. 黃芪總苷對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后BDNF, TrkB和p75NTRmRNA表達的影響[J]. 中國藥理學通報,2009,25 (5):672-676.

[14]陳玲,韓江全,李文錦. 不同劑量川芎嗪和葛根素配伍對腦缺血大鼠神經元凋亡的影響[J]. 成都醫學院學報, 2015,10(3):276-280.

[15]Cao YL, Chen CF, Wang AW, et al. Changes of peripheral-type benzodiazepine receptors in the penumbra area after cerebral ischemia-reperfusion injury and effects of astragaloside Ⅳ on rats [J]. Genet Mol Res, 2015,14(1):277-285.

[16]Zhou F, Wang L, Liu P, et al. Puerarin protects brain tissue against cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting the inflammatory response [J]. Neural Regen Res, 2014,9(23):2074-2080.

[17]Wang N, Zhang Y, Wu L, et al. Puerarin protected the brain from cerebral ischemia injury via astrocyte apoptosis inhibition [J]. Neuropharmacology, 2014,79:282-289.

[18]馬賢德,王守巖,張威．眼針對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織 BDNF、p75NTR表達影響及其腦保護作用機制[J]. 北京中醫藥大學學報,2014,37(1):48-52．

[19]田甜,車念聰,龍建飛,等. 大腦中動脈栓塞大鼠缺血半暗區神經可塑性蛋白及神經因子的表達[J]. 中國神經精神疾病雜志,2015,41(1):15-19.

Effect of Compound Angelica Injection on expression of brain derived neurotrophic factor of rats with cerebral ischemia injury

TANG Yibo, YUAN Weichang, ZHU Chunyan, ZHANG Sai, ZHANG Wei, ZHANG Linpeng, NAN Yinan，MU Tianlong,WANG Xu，YANG Xiaomin,HE Xuefei, PAN Yanshu

(Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Compound Angelica Injection (CAI) on the expressions of brain derived neurotrophic factor (BDNF) in brain tissue and serum in the rats with cerebral ischemia injury, and to explore the related mechanism of effect of CAI on cerebral ischemia injury. Methods50 SD rats were randomly divided into sham operation group (n=10) and cerebral ischemia injury group (n=40), and the rats in cerebral ischemia injury group were reproduced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Thirty successfully modeling rats were randomly divided into model group, CAI group and edaravone group (n=10). The neurologic scores of the rats after waking up were measured. The pathomorphology of brain tissue of the rats was detected by HE staining 7 d later. The levels of BDNF in the brain tissue and serum of the rats were detected. Results Compared with sham operation group, the neurologic score of the rats in model group was increased (P<0.05); the neurocytes of rats were changed to swell, necrosis, and interstitial edema; the levels of BDNF in brain tissue and serum showed a tendency of increasing; the level of BDNF in brain tissue of the rats in CAI group was increased significantly (P<0.05), and the serum BDNF level was a little higher. Compared with model group, the neurologic score of the rats in CAI group was decreased (P<0.05); the neurocytes of rats were mild edema; the levels of BDNF in brain tissue and serum showed a tendency of increasing. Conclusion CAI may has a positive function in increasing BDNF expression,and the mechanism may be related to the stress reaction of corresponding neural factors in brain tissue under ischemia injury condition.

Compound Angelica Injection;focal cerebral ischemia; brain derived neurotrophic factor;disease models,animal

1671-587Ⅹ(2015)06-1103-04

10.13481/j.1671-587x.20150601

2015-08-21

國家自然科學基金資助課題(81271897)；國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助課題(2012CB518602)；北京中醫藥大學自主項目資助課題(2013-JYBZZ-JS-120)

湯軼波(1980-)，女，江蘇省張家港市人，講師，醫學博士，主要從事中醫藥治療缺血性腦病方面的研究。

潘彥舒，教授，碩士研究生導師(Tel: 010-64286887，E-mail: panyanshu@263.net)

R285.5

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