加味黃芪建中湯對脾虛證肺癌小鼠腫瘤轉移及HIF-1α、V-ATPase c mRNA表達的影響

包素珍，陳 淇，張譽引

（浙江中醫藥大學，浙江杭州310053）

肺癌是一種嚴重危害人類健康的疾病。據統計，中國的肺癌發病率及死亡率均居惡性腫瘤中的第一位［1］，且呈逐年遞增態勢［2］。目前患者的 5 年生存率仍然過低，易發生腫瘤轉移，而腫瘤轉移是治療失敗及患者死亡的首要原因［3］。腫瘤的侵襲、轉移與多種基因突變、分子通路改變有關，更是與其乏氧酸性微環境有顯著的關聯［4］。臨床上，我們發現脾虛證是肺癌辨證中的常見證型。在前期研究基礎上，本實驗對加味黃芪建中湯對脾虛肺癌小鼠腫瘤轉移及HIF-1α、V-ATPase c mRNA表達的影響進行了探索，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及瘤株 C57BL/6小鼠（浙江中醫藥大學實驗動物中心），小鼠Lewis肺癌瘤株（浙江中醫藥大學中醫臨床基礎實驗室提供）。

1.1.2 實驗藥物 加味黃芪建中湯：黃芪、白芍、桂枝、甘草、生姜、大棗、飴糖、浙貝母、白花蛇舌草、仙鶴草，經水煎、過濾、滅菌，制成含生藥1.00 g/mL的藥液；生大黃粉加蒸餾水，50℃水浴5 h后，經旋蒸儀于50℃負壓濃縮成含生藥1.00 g/mL的大黃液。上述藥物均在4℃冰箱保存備用。

1.1.3 試劑與儀器 RNAiso Plus RNA提取試劑、SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ、PrimeScriptTMRT Master Mix（大連寶生物工程有限公司），V-ATPase c、gapdh引物（上海生工生物工程技術服務有限公司），HIF-1α單克隆抗體（美國Novus Biologicals公司），山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（北京中杉金橋生物技術有限公司），7500型實時定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。

表1 RT-PCR引物的序列、堿基數

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 C57BL/6雌性小鼠，30只，6～8 w齡，經3 w常規飼養適應環境，體重（20±2）g，隨機取20只小鼠，采用苦寒瀉下（大黃液灌胃，每日1 mL/20 g）、過度疲勞（每日強制游泳至耐力極限為止）及隔日禁食16 h建立脾虛證模型，連續14 d；其余小鼠在正常環境下飼養。取接種第14天的新鮮無壞死Lewis肺癌組織，加生理鹽水制作成腫瘤細胞懸濁液，調整濃度，顯微鏡下計數為1×107個/mL。取0.2 mL上述懸濁液，注射于小鼠右側腋部皮下。

1.2.2 分組及給藥 瘤株接種后，將小鼠分為肺癌對照組、脾虛肺癌組、脾虛肺癌治療組，每組10只。脾虛肺癌治療組以加味黃芪建中湯灌胃，每日0.4 mL/20 g；肺癌對照組、脾虛肺癌組以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 指標檢測 觀察并記錄小鼠整體狀態變化，如精神、活動、大便、體重、毛發等，接種瘤株后第10天處死，取肺臟，壓片法計肺結節數。無菌剝取瘤塊，RT-PCR法檢測V-ATPase c mRNA表達，Power Vision法檢測HIF-1α的表達，用Image-Pro Plus 6.0測量陽性反應物的累積光密度（IOD）。

1.3 統計學方法

用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料采用均數±標準差（±s）進行統計描述，組間比較采用t檢驗、單因素方差分析等。均采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀態

造模第2天起，小鼠出現便溏；第5天起，出現蜷縮、扎堆、弓背；第7天起，出現明顯的體重下降，游泳時間縮短；第13天起，見毛發稀疏發黃，無光澤。符合脾虛證模型標準。

2.2 各組肺轉移結節數比較

與肺癌對照組比較，脾虛肺癌組肺轉移結節數增多（P＜0.05）；與脾虛肺癌組比較，脾虛肺癌治療組肺轉移結節數減少（P＜0.01）。結果見表2。

2.3 各組腫瘤組織中HIF-1α陽性表達累積光密度（IOD）值、V-ATPase c/gapdh基因表達比較

表2 各組肺轉移結節數比較 （±s）

表2 各組肺轉移結節數比較 （±s）

注：與肺癌對照組比較，1）P＜0.05；與脾虛肺癌組比較，2）P＜0.01

組別 肺轉移結節數（個）肺癌對照組 1.40±0.690脾虛肺癌組 2.60±1.5701）脾虛肺癌治療組 0.50±0.7042）

結果見表3。

表3 各組腫瘤組織中HIF-1α陽性表達累積光密度值比較（±s）

表3 各組腫瘤組織中HIF-1α陽性表達累積光密度值比較（±s）

注：與肺癌對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與脾虛肺癌組比較，3）P＜0.01

組別 HIF-1α陽性表達累積光密度值 V-ATPase c/gapdh肺癌對照組 6693.77±3577.010.02832±0.01060脾虛肺癌組 13443.40±5645.172） 0.05699±0.014241）脾虛肺癌治療組 4208.46±2454.782）3） 0.05703±0.017881）

HIF-1α陽性表達于腫瘤細胞的細胞質和（或）細胞核，陽性細胞主要出現在腫瘤組織邊緣。腫瘤壞死組織呈假陽性，正常組織呈陰性。由表3可見，與肺癌對照組比較，脾虛肺癌組HIF-1α陽性表達IOD值升高（P＜0.01），脾虛肺癌治療組HIF-1α陽性表達IOD值降低（P＜0.01）；與脾虛肺癌組比較，脾虛肺癌治療組HIF-1α陽性表達IOD值降低（P＜0.01）。與肺癌對照組比較，脾虛肺癌組、脾虛肺癌治療組VATPase c/gapdh比值升高（P＜0.05）；與脾虛肺癌組比較，脾虛肺癌治療組V-ATPase c/gapdh比值升高，但差異無統計學意義。

3 討論

實體腫瘤的生長過程中，微環境會因腫瘤細胞增殖迅速而始終處于乏氧狀態，并使得糖酵解增強，產生大量酸性代謝產物，呈酸性微環境［5］。因此，乏氧和酸性是腫瘤微環境的重要特征，并為腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移提供條件［6］。細胞乏氧反應中，HIF-1α處于核心控制地位［7］。HIF-1α上調后，可通過上調細胞運動、基質降解，下調細胞黏附分子表達等環節，促進實體瘤的侵襲與轉移［8］。孫國貴等［9］分析 1488例非小細胞肺癌病理及臨床資料，發現在非小細胞肺癌中HIF-1α呈高表達，且隨著過表達的增加，腫瘤轉移范圍隨之廣泛。

V-ATPase廣泛存在于真核細胞的胞膜系統中，能逆濃度梯度地將H+轉運到細胞外［10］，是腫瘤細胞在酸性微環境中侵襲、轉移的重要pH調節機制。VATPase c是位于V-ATPase V0功能區的亞基，主要功能是負責氫離子轉運，是維持V-ATPase活性及功能的重要蛋白。而V-ATPase活性與腫瘤侵襲、轉移密切相關［11］，V-ATPase c 高活性可上調 MMP-2 分泌，增強腫瘤細胞的浸潤能力；同時V-ATPase活性增加，導致腫瘤微環境酸化，是結締組織膠原纖維降解的重要機制之一，促進了腫瘤的侵襲與轉移。

本實驗通過復因素法建立脾虛小鼠模型，接種Lewis肺癌，以加味黃芪建中湯治療。可知脾虛證肺癌小鼠的HIF-1α、V-ATPase c mRNA的表達上調，肺轉移結節數增多，提示脾虛證加重了小鼠的肺癌微環境中的乏氧及酸性情況，促進肺癌的轉移。予加味黃芪建中湯后，HIF-1α的陽性表達明顯下降，且優于肺癌對照組，說明加味黃芪建中湯能改善腫瘤微環境中的乏氧狀態，與李恒楠等［12］通過健脾法治療脾虛證肺癌小鼠下調HIF-1α mRNA表達相符合；健脾抗癌治療后，肺轉移結節數明顯下降，與艾葉盛等［13］運用黃芪建中湯抑制脾虛證肺癌小鼠腫瘤轉移相符合。V-ATPase c mRNA在脾虛肺癌組和脾虛肺癌治療組中表達無差異，考慮有以下幾種可能：①加味黃芪建中湯不能下調V-ATPase c mRNA的表達及改善酸性微環境。②脾虛證腫瘤微環境及加味黃芪建中湯對腫瘤的影響，是與多種基因的表達及分子通路改變有關，可能有其他基因表達或通路改變影響了V-ATPase c mRNA的表達。③當VATPase c的活性受到抑制時，腫瘤細胞內的H+蓄積過多，pH值下降，反射性地誘導V-ATPase c mRNA的表達上調［14］。④加味黃芪建中湯的作用與V-ATPase c mRNA的表達存在一定的時間差，基因表達具有時間特異性和空間特異性。⑤V-ATPase的各級結構及蛋白間作用復雜，受多種因素調節。其具體原因，有待進一步實驗研究。

診治上采用辨證辨病相統一，針對脾虛證型，以黃芪建中湯健脾補虛；針對肺癌疾病特點，加浙貝母軟堅散結，白花蛇舌草解毒抑瘤，輔以仙鶴草補虛抗癌，全方健脾解毒扶正抗癌，抑制腫瘤轉移，其機制可能與改善因脾虛證而加重的乏氧微環境狀態有關。

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