硝基苯脅迫對綠豆種子萌發及根尖細胞死亡的研究*

王曉蕾，劉 聰

(哈爾濱師范大學)

0 引言

硝基苯別名色斑油，作為生產精細化學產品的中間體，是人工合成的化合物.硝基苯類物質主要來源于原油及焦油的提取，廣泛應用于石油化工、藥物研發、紡織印染等諸多領域.全世界每年排入環境中的硝基苯類化合物約為1萬t.硝基苯是高毒性物質，其毒性一般為其他化合物的20～30倍，且具有致突變性，長期接觸，對人體及動植物危害極大［1］.

近年來，隨著工業的發展，水體環境中硝基芳烴類物質的污染日益嚴重，已經成為人們關注的焦點問題.國內外對硝基苯類化合物的研究相當活躍，(1)研究了硝基苯的環境行為、生態學特性及在水生生物體內的富集作用及其引起的毒性毒理機制［2－6］;(2)硝基苯對植物的種子萌發、幼苗生長和生理特性的影響進行了報道，研究表明種子的發芽率和幼苗生長受硝基苯影響，硝基苯引起植物細胞遺傳損傷，誘導植物細胞壞死及凋亡的產生［7－14］.該文選用綠豆作為實驗材料，對硝基苯脅迫下綠豆種子萌發及根尖的損傷及細胞死亡進行研究，為探討硝基苯的毒性及遺傳損傷機理提供一定的參考.

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料:綠豆(Phaseolus radiatusL)，購買于哈爾濱市種子公司.

1.2 試驗設計

種子萌發試驗:選取飽滿、大小均勻、色澤一致、無霉變的種子，用濃度為5%的次氯酸鈉溶液殺菌10min，用蒸餾水將種子上殘留的次氯酸鈉溶液沖洗干凈.室溫條件下將綠豆種子浸泡在水中，使種子吸脹24h.選取吸脹良好、大小一致的綠豆，隨機分成6組，每組50粒.取6個大小相同的培養皿，以雙層濾紙作為支持物，將綠豆均勻平鋪于濾紙表面.25℃恒溫培養箱萌發7 d.重復3次.

根尖遺傳損傷試驗:處理與上面相同，水培法萌發綠豆7 d，綠豆根長為1.5 cm左右.將水培萌發的綠豆根尖插入紗布縫隙中，室溫下通風廚內不同濃度的硝基苯染毒處理24h.處理24h后，剪下綠豆根尖放置于－80℃的冰箱中冷凍保存.

1.2.1 硝基苯濃度的設置

濃度為:5，10，25，50，100 mg/L 的硝基苯溶液，同時設置對照處理，對照為水.

1.2.2 測定指標及方法

種子培養期間每天觀察并記錄發芽及生長情況，計算發芽率、胚芽、胚根長度.

利用CTAB法提取綠豆根尖DNA.DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測根細胞損傷.

1.2.3 數據分析

統計學軟件SPSS 17.0對實驗組和對照組進行差異顯著性分析.

DNA凝膠成相系統觀察，并拍照.

2 結果與分析

2.1 硝基苯對綠豆種子萌發率的影響

實驗結果見表1，當硝基苯濃度為25 mg/L，綠豆萌發率與對照差異不顯著，基本上沒有影響.但硝基苯濃度為 50，100，200，300 mg/L 時發芽率 分 別 為 92.78%、85.94%、80.18%、70.67%，與對照差異顯著.可見隨著硝基苯濃度的升高對綠豆種子萌發抑制作用增加.

表1 不同濃度硝基苯對綠豆種子萌發的影響

2.2 硝基苯對綠豆胚芽、胚根長度的影響

表2 不同濃度硝基苯對綠豆種子胚芽長度的影響

表3 不同濃度硝基苯對綠豆種子胚根長度的影響

實驗結果見表2及表3，實驗表明，隨著硝基苯濃度的增加，綠豆種子的胚芽長度及胚根長度受抑制程度逐漸增大.硝基苯脅迫下的綠豆胚芽長度及胚軸長與對照差異顯著.

雖然硝基苯濃度為25 mg/L，綠豆萌發率與對照差異不顯著，但它的胚芽長度及胚根長度與對照相比差異顯著，會影響綠豆出苗率.

2.3 綠豆根尖細胞基因組DNA的分析

實驗結果見圖1.電泳結果顯示，各硝基苯處理組均出現拖尾帶，隨著硝基苯濃度的增加，拖尾現象越明顯.并沒有出現典型DNA梯狀條帶.植物細胞在應對外界環境的毒素刺激時，有細胞凋亡和細胞壞死兩種方式.細胞發生凋亡，會使核酸內切酶激活，基因組的DNA在核小體連接區發生非隨機性降解，產生寡核小體片段，其大小相當于核小體(160～200bp)的倍數，在瓊脂糖凝膠電泳中可見特征性的“梯”狀(ladder pattern)條帶.因此可以用瓊脂糖凝膠電泳圖譜檢測細胞凋亡的發生.而當細胞受到外界的刺激而引起細胞壞死時，常由細胞損傷因子引起DNA的無規則斷裂，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上呈現模糊的彌散狀條帶.該實驗中各濃度硝基苯處理組的DNA電泳結果均出現彌散狀的拖尾帶圖，但未見明顯的梯形條帶，可能是由于彌散帶掩蓋了梯形條帶.即在硝基苯溶液的誘導下，綠豆根尖發生細胞壞死與細胞凋亡共存的情況.

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖譜

3 討論

徐應明等進行過硝基苯脅迫小麥種子萌發和幼苗生理特性的影響研究，發現在水培條件下，當硝基苯濃度在50 mg·kg－1以上時，小麥種子發芽停止，硝基苯能明顯地抑制小麥種子萌發和幼苗的生長，幼苗干重、鮮重存在不同程度的下降，受害程度隨硝基苯濃度的增加而加重［10］.劉小民等研究表明:隨著硝基苯濃度的增加，綠豆根長、下胚軸長受抑制率逐漸增大.硝基苯脅迫下的綠豆根長、下胚軸長與對照差異顯著［11］.這與該實驗研究結果相似，硝基苯能明顯影響綠豆種子的萌發.

馬軍、劉宛等研究表明硝基苯能誘發蠶豆根尖細胞較高頻率的微核，并能誘發產生染色體斷片、染色體橋、染色體滯留等遺傳畸變現象［9，12－13］.認為硝基苯對蠶豆細胞具有遺傳損傷，可能直接誘發染色體斷裂，也可能通過激發細胞內的自由基反應而導致染色體畸變，這些遺傳損傷使植物對逆境作出反應，激活其凋亡相關程序，產生PCD(細胞凋亡).該實驗的DNA電泳結果表明硝基苯在綠豆種子萌發過程中可引起根尖細胞的死亡，但是細胞壞死與細胞凋亡共存［14］，通過DNA凝膠電泳尚不能確定以哪一種死亡方式為主，需要結合其他實驗方法進行判斷.

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［14］張躍華，冉超，商艷艷，等.硝基苯對蠶豆根尖細胞凋亡的研究［J］.生物學通報，2007，42(1):47－48.