影響口蹄疫貼壁種毒質量因素的探討與分析

李培林等

摘 要：口蹄疫滅活疫苗目前仍然是控制口蹄疫的主要手段，隨著懸浮工藝和純化工藝的改進，使口蹄疫滅活疫苗的質量有很大的提高。探討了細胞狀態、接毒量和毒液保存條件對種毒質量的影響。結果表明，細胞狀態影響收毒時間的變化，同時一定程度上也影響LD50的變化；接毒含量增高，收獲時間縮短，而低劑量、正常劑量接毒傳代試驗均能獲得合格的種毒支系，適宜的改變接毒量有助于提高種毒質量；不論是4 ℃冷藏保存還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價均有不同程度的損失，而且4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式。

關鍵詞：BHK-21細胞；口蹄疫滅活疫苗；種毒制備；質量控制

中圖分類號：S852.659.6 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2015）07-0007-03

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴重危害畜牧業的發展[1，2]。OIE將該病列為A類家畜傳染病之首，而我國農業部也把該病列為第一類防控疫病。對于口蹄疫的防控，目前仍以滅活疫苗為主。此項措施在我國重大疫情中發揮巨大防治作用。

對于口蹄疫疫苗生產企業，質量的提高，產品創新以及員工素質提高是企業發展的動力。因此，疫苗質量的提高離不開工藝革新以及基礎方面的優化研究。工藝革新是疫苗制備企業的硬件系統，由企業的綜合實力決定。而基礎研究主要包括：種細胞的馴化與篩選、種毒的優化制備及抗原純化等相關研究[3，4]。從種毒制備人員的自身素質講，篩選制備出良好的種毒，不僅給疫苗前端解決了問題，而且也給后端工藝帶來可喜的成果。因為種毒質量好壞、抗原含量高低，直接影響口蹄疫抗原中的有效成分，而且關系到疫苗的免疫效果。在生產中獲得一支理想的種毒支系，不僅給生產人員帶來方便，而且也給企業帶來很大的經濟收益。因此，制苗毒株的選擇及質量的提高是疫苗生產的首要問題[6]。

篩選優質的種毒需要有正確的操作方法更需要掌握影響種毒質量的一些因素。目前，影響貼壁種毒因素主要有細胞貼壁狀態、維持液的酸堿度、接毒量、最佳收獲時間、檢驗周期、種毒保存時間以及種毒傳代路線及無菌觀念等。因此，本次試驗主要探討影響種毒質量的一些因素，并進行分析與總結，從而通過過程控制，調整傳代條件、保存方法，篩選出毒價穩定、146S高的基礎種毒，從而保障種毒質量，提高企業競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備 CO2培養箱（Thermo 8000WJ）；生物安全柜（HFsafe-1200型）；倒置顯微鏡清（OLMPUS）；4 ℃平溫冰箱；-20 ℃臥式冷凍冰柜；溫室、生物細胞轉瓶機、細胞觀察臺；超低溫冰箱（Thermo ULT1386-3-V41）、移液器、恒溫震蕩培養箱等儀器。

1.1.2 BHK-21細胞 由金宇保靈生物藥品有限公司提供，分種傳代一般按1∶3～1∶4進行操作，加入營養液，置37 ℃培養箱中培養。營養液配制按本公司的配液SOP進行操作。

1.1.3 O型口蹄疫基礎種毒 由金宇保靈生物藥品有限公司質量檢驗部提供FMDV基礎種毒。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細胞貼壁狀態對種毒的影響 按常規細胞傳代的方法，將細胞復蘇傳代后，將同批培養24、48、53、72、96 h細胞，每瓶細胞換液，加入病毒維持液100 mL，同時每個培養時間設兩個重復，分別按5%～8%的接毒量接毒，接毒完成后置CO2培養箱37 ℃培養6～8 h觀察，病變達到90%時收獲病毒冷凍保存后混勻測病毒含量（取平均值）。

1.2.2 改變接種比例對篩選種毒的影響 選同批48 、72 h培養階段的BHK-21細胞，細胞換液，加病毒維持液100 mL，一組以7%～8%的接毒量接毒，另一組以1%接毒量接毒，置CO2培養箱37 ℃培養6～8 h觀察，病變達到90%時收獲病毒冷凍保存后混勻測病毒含量，連續傳代3次。

1.2.3 不同保存方式對種毒質量的影響 通過測毒結果篩選出毒價高和毒價低的種毒，然后分別將上述兩種種毒，進行4 ℃和-20 ℃冷凍保存，保存期限為210 d，經過測毒結果分析計算不同時間毒價的損失率，毒價損失率=原樣毒價-不同時間段的毒價/原樣毒價，記錄結果。

1.2.4 LD50測定 用pH為7.6～7.8的細胞維持液將待測各批次種毒樣品進行10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-9 3個稀釋度，每個稀釋度頸背部皮下接種2～3日齡乳鼠4只，設對照2只，每只注射0.2 mL，接種后觀察7 d，根據發病死亡乳鼠數按Reed-Muench法計算LD50。

2 結果與分析

2.1 BHK-21細胞貼壁狀態對種毒因素的影響

由表1、圖1可知，隨著BHK-21細胞培養時間的延長，即細胞從24 h到96 h 的過程中，細胞表現基本形成單層、致密單層、脫落等現象的發生。因此，選擇不同培養時間段的細胞，對篩選種毒支系有一定的影響，從上述數據分析可知，細胞培養時間與收毒時間存在一定的相關性，從LD50毒價（LD50的值為10N LD50/0.2 mL中N的值，下同）分析可知，毒價上升的階段對應的是細胞48～72 h培養階段。

2.2 改變接種比例對篩選種毒的影響

從表2可知，按7%～8%種毒含量，連續傳3代，種毒LD50基本在7.5～8.0范圍內變化，說明按7%～8%正常含量接毒，可以得到理想的種毒支系。而且可以保證抗原的正常生產。從收毒時間分析，隨著代次的增加收毒時間逐漸在縮短，而細胞顆粒飽滿時間基本穩定在8.5～11.5 h范圍內。

從表3低劑量組數據分析可知，以1%種毒含量進行接毒傳代，種毒LD50在7.0～8.0范圍內變化，而且通過收毒時的觀察，SY001F10代毒價不合格，通過后續連續傳代，收毒時間縮短毒價升高，可以初步證明，用低劑量接毒方法可以盲傳兩到三代，毒價基本趨于合格。說明這種傳代方法，可以達到生產的要求，而且這種工藝有一定的可行性。經表2與表3對比分析可知，正常劑量組與低劑量組種毒傳代方式最大的不同，種毒含量高收毒時間快，種毒含量低收毒時間慢，即種毒含量的多少與收毒時間呈一代的正相關性，測毒結果與細胞病變情況，兩種方式基本一致。

2.3 貼壁種毒不同保存方式對種毒質量的影響

從表4、圖2可知，不論是4 ℃保存和還是

-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價均有不同程度的損失，從保存條件分析，4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式。從毒價高低分析可知，在大部分保存時間內，在4 ℃保存高毒價的下降率明顯低于4 ℃保存低毒價的下降率，而-20 ℃保存方式也有上述規律，這就說明，保存方式和毒價高低影響貼壁種毒的質量。

3 討論

3.1 BHK-21細胞貼壁狀態及傳代穩定性對篩選種毒質量的影響

細胞培養時間、分種比例、細胞營養液以及不同種類的血清與添加量，均能影響貼壁細胞狀態與形態。而本次試驗在固定分種比例、營養液以及血清因素同時，只考慮細胞培養時間對篩選種毒支系的影響，旨在探討細胞培養時間與種毒質量的關聯性。在實際工作中，細胞狀態是指細胞的致密程度、融合率及細胞肉眼觀察情況。細胞狀態影響收毒時間的變化，同時也一定程度上影響LD50毒價的變化。一般情況，不同培養階段BHK-21細胞，細胞的致密度與薄厚度不一致，在接毒量一致的情況下，細胞培養時間會影響CPE收獲時間，從而間接的影響毒價。在實際工作中，盡量選擇細胞形態好，培養時間在48～72 h細胞進行接毒，同時在工作中加無菌觀念意識，在一定程度上，利于篩選優質的種毒。

3.2 不同的接種比例對篩選種毒的影響

在細胞狀態良好，細胞培養時間一定的情況下，貼壁種毒接毒含量增高，收獲變時間縮短，反之亦然。經報道，接毒量高低直接影響病毒繁殖周期，細胞病變快慢直接影響細胞維持液的酸堿度及營養物質的消耗快慢，這些因素的變化會直接影響完整病毒粒子的情況。通過本次試驗結果可知，低劑量、正常劑量接毒傳代試驗均能獲得合格的種毒支系。因此，在實踐中，適宜的改變接毒量有助于提高種毒毒價。所以，在種毒傳代中多注意上述問題。

3.3 貼壁病毒液的不同保存條件對種毒質量的因素的影響

在口蹄疫滅活疫苗制備過程中，不可避免的要將基礎種毒、抗原滅活液、成品苗進行保存，選擇適宜的保存條件和儲備方法，對疫苗質量的提高有一定的指導意義。大量資料報道表明[5]，冷鏈系統是口蹄疫苗的主要儲存和運輸方式，可見如何有效的保存疫苗終端產品也是疫苗質量提高的關鍵。本次試驗證明，不論是4 ℃平穩保存和還是-20 ℃冷凍保存，隨著保存時間的延長，毒價勻有不同程度的損失，而且4 ℃保存的毒液下降率明顯低于-20 ℃保存方式，本次結果與一些報道有所差距。經查閱資料分析有如下原因所致，因為在保存口蹄疫抗原或毒液時，大部分采用的是緩沖體系來保存，在4 ℃或-20 ℃保存條件下，-20 ℃保存條件下更容易使緩沖體系酸堿度發生變化，從而使毒液中的完整病毒粒子更容易降解，影響口蹄疫病毒質量。

疫苗制備過程是一個系統過程，此次試驗只是從種毒方面進行了初步探討，細胞培養時間的變化、接毒量的變化以及毒液保存條件的改變對貼壁種毒質量的影響。因此，在實際工作中細化深入的研究，對口蹄疫疫苗質量的提高會有一定的指導意義。

參考文獻：

[1] COX S J， BARNETT P V. Emergency vaccination of sheep against foot and mouth disease：protection against disease and reduction in contact transmission[J]. Vaccine， 1999， 17： 1855-1868.

[2] MURRAY P.K. A review of foot and mouth disease international vaccine banks. In Proc. National symposium on foot and mouth disease[J]. Australian Government Publication Service， 1992，10：115-123.

[3] DETROY R W，STILL P E.Penicillium stoloniferum virus： large-scale concentration and purification by polyethylene Glycol[J]. American Society for Microbiology，1974 ，10：733-735

[4] PANINA G F， SIMONE F D.Immunological activity of foot-and-mouth disease virus purified by polyethylene glycol precipitation[J]. Verlag Paul Parey， Berlin und Hamburg，1973， 20：773-782 .

[5] ALLENDE R M. South American standards for Foot-and-mouth disease vaccine quality[J]. Foot-and-mouth Disease： Control Strategies， 2003，10：331-336.

[6] 王永錄，張永光.口蹄疫A型滅活疫苗毒種和種子批的研究[J]中國獸醫科學，2006，36（5）：371-375.