脊髓小膠質細胞P2X4受體在rrTNF誘導的病理性疼痛中的作用*

宮慶娟， 汪紅華， 梁 穎， 盧振和， 陳金生， 黃喬東， 越 宇

(廣州醫科大學附屬第二醫院疼痛科，廣東廣州 510260)

坐骨神經周圍給予重組大鼠腫瘤壞死因子α(recombinant rat TNF-α，rrTNF)可引起大鼠后爪機械性痛閾下降和熱痛反應增強［1］，rrTNF在體內半衰期只有十幾分鐘，卻可引起大鼠持續約20 d的病理性疼痛，其具體的機制仍不清楚。已有研究顯示，TNF-α通過小膠質細胞系統介導神經病理性疼痛［2］。大量研究發現，脊髓背角小膠質細胞的P2X4受體在神經病理性疼痛和嗎啡耐受中發揮重要作用［3-6］;而且我們以前的研究發現，脊髓表面應用ATP，ATP通過上調小膠質細胞P2X4受體的表達，誘導C纖維誘發電位的長時程增強(long-term potentiation，LTP)［7］，脊髓背角 LTP 被認為是病理性疼痛的神經基礎［8］。因此我們設想P2X4受體同樣參與坐骨神經周圍給予rrTNF引起的大鼠病理性疼痛。

材料和方法

1 實驗動物

實驗采用成年雄性SD大鼠(180～200 g)，清潔級標準，由省動物實驗中心提供。動物分籠飼養，自由飲食，室溫保持在(24±1)℃和50～60%的濕度，所有實驗步驟都盡量減輕動物的痛苦并按照有關實驗動物的使用原則操作。

行為學測試大鼠分為生理鹽水(NS)組、TNPATP和PPADS組。Western blot實驗大鼠分為rrTNF 100 ng/L 組(3 d、7 d、14 d)、溶劑組(0.1%牛血清白蛋白即0.1%BSA)和naive對照組以及NS組、TNPATP和PPADS組。

2 藥物和試劑

rrTNF(R＆D)以10 mg/L的濃度保存在－80℃，給藥前立即用含有0.1%BSA的生理鹽水稀釋為100 ng/L。TNP-ATP［2’，3’-O-(2，4，6-trinitrophenyl)adenosine 5-triphosphate］和 PPADS(pyridoxal phosphate 6-azophenyl-2’，4’-disulphonic acid)購于Sigma。TNP-ATP和PPADS先用雙蒸水溶解成儲存液，在臨用前用生理鹽水分別稀釋成所需要的濃度。

3 方法

3.1 PST模型的制備——坐骨神經周圍植管與給藥 參照Wei［1］的方法制備埋置在坐骨神經周圍的植管。將明膠海綿切成15 mm×5 mm×9 mm的塊狀。其中一端被分成兩半并插入一根4 cm長的PE-10管，并用線將 PE-10管與明膠海綿固定在一起。70%乙醇浸泡15 min，無菌超凈臺吹干備用。用10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg，ip)大鼠，然后于左后肢備皮，碘酒及酒精局部消毒。將上述裝置中的明膠海綿包裹在分離好的左側坐骨神經上，通過PE-10管注入200 μL、100 ng/L的 rrTNF 或0.1%BSA。每天1次，共2 d。

3.2 鞘內置管與給藥 TNP-ATP和PPADS用生理鹽水分別溶解至23.7 g/L和30 g/L。大鼠消毒，暴露出L6棘突，用1 mL注射器針頭在L5/L6椎間隙刺入蛛網膜下腔，可看到大鼠甩尾，同時左手將PE-10管用眼科彎鑷持住沿小口進入，向前1 cm即可，此時可看到清亮腦脊液出來，固定好PE-10管，縫皮，單籠飼養，等大鼠恢復一段時間后再通過PE-10管注入TNP-ATP或PPADS，每次注射10 μL，連續注射7 d。前2次給予TNP-ATP或PPADS 10 min后再在坐骨神經周圍給予rrTNF。

3.3 Westen blot實驗 如我們以前文章［9］所述的方法進行，首先分離大鼠L4～L6段脊髓，取給藥同側脊髓背角，分別按重量加入 Tris裂解緩沖液(0.1%SDS，1%NP-40，1 μmol/L OA，0.02%NaN3，10 mmol/L EGTA，0.2 g/L trypsin inhibitor，1 mmol/L NaVO4，1 mmol/L PMSF，protease inhibitor cocktail tablet)，低溫勻漿，超聲破碎。12 000 r/min低溫離心，取上清液。用Micro-BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品加入6 μL上樣緩沖液，混勻后，沸水煮沸10 min。SDS-PAGE分離蛋白，200 V電泳45 min，后100 V、1 h轉至PVDF膜上，室溫封閉 1 h，孵育抗 P2X4受體抗體(1∶500，Alomone)或抗TNF-α 抗體(1∶1 000，Abcam)4℃ 過夜 ，漂洗3次，用辣根過氧化物酶標記的II抗孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色1～3 min，曝光。計算機行灰度掃描，定量分析。

3.4 免疫熒光染色 坐骨神經周圍給予rrTNF后7 d的大鼠，首先灌注300 mL生理鹽水，然后灌注350 mL冷的含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB)。取出 L4～L5脊髓，后固定3 h，隨后轉入30%蔗糖中4℃ 2 d。在冰凍切片機(Leica CM3050S)進行脊髓橫切面的切片(25 μm)，如文獻［6］所述的方法進行熒光染色。簡言之，切片用含3%驢血清0.3%Triton室溫封閉1 h，孵育抗P2X4受體抗體(1∶100)、神經元標志物神經元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)抗體(1∶500;Chemicon)、星形膠質細胞標志物膠質細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(1∶500;Chemicon)和小膠質細胞標志物 Iba-1(1∶500;Serotec)的混合液4℃過夜，然后加入FITC和Cy3標記的2種II抗(1∶200;Jackson)，室溫下反應1 h。染色的切片于Olympus IX71(Olympus)熒光顯微鏡下觀察并用CCD相機拍照。

3.5 50%機械刺激撤足閾值的測定 為了使大鼠熟悉并適應測試環境，消除大鼠心理因素對測試結果的影響，將大鼠放置于測試的有機玻璃箱內約10 min，待大鼠安靜后，采用 Up-Down 方法［1］，選 8 根強度呈對數遞增方式的 von Frey hair(0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51 和 15.14 g)分別對大鼠后肢左右腳足心部進行機械性刺激，每次刺激持續時間為6～8 s。以2.04 g刺激強度為初始刺激強度，若撤足反應為陰性，則選用刺激強度呈對數遞增的相鄰von Frey hair繼續刺激;若撤足反應為陽性，則選擇相鄰遞減的刺激強度給予刺激。

4 統計學處理

統計檢驗用SPSS 17.0處理。所有的數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示。行為學測試結果采用非參數檢驗進行分析，同一組大鼠不同測試時點的數據先用Friedman ANOVA檢驗差異，然后再用兩組相關數據的秩和檢驗分析。Western blot結果用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的凈吸光度值，使用單因素方差分析進行統計分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 坐骨神經周圍給予rrTNF-α后同側脊髓背角小膠質細胞P2X4受體的表達水平明顯升高

已有證據表明P2X4受體是神經病理性疼痛的一個關鍵分子［3-5］，因此我們檢測坐骨神經周圍給予rrTNF后脊髓背角P2X4受體的表達是否增加。結果顯示，與naive組或vehicle組相比，坐骨神經周圍給予rrTNF后3 d、7 d和14 d同側脊髓背角P2X4受體的表達明顯上調，見圖1。為了確定激活的P2X4受體在哪種細胞表達，在坐骨神經周圍給予rrTNF后7 d進行免疫熒光雙染，發現P2X4受體僅與Iba-1存在共染，與GFAP或NeuN不存在共染，表明坐骨神經周圍給予rrTNF后同側脊髓背角小膠質細胞而不是星形膠質細胞或神經元的P2X4受體的表達水平明顯升高，見圖2。

Figure 1.The expression of P2X4receptor in the spinal dorsal horn significantly increased after peri-sciatic administration of rrTNF(PST).Mean±SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs naive group.圖1 坐骨神經周圍給予rrTNF后脊髓背角P2X4受體的表達水平明顯升高

Figure 2.P2X4receptor was co-localized only with microglia in spinal dorsal horn after peri-sciatic administration of rrTNF.圖2 坐骨神經周圍給予rrTNF后P2X4受體在脊髓背角小膠質細胞表達

2 阻斷P2X4受體抑制坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的機械痛敏

為了評價P2X4受體在坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的機械痛敏中的作用，在坐骨神經周圍給予rrTNF的大鼠前鞘內應用給予2種P2X受體拮抗劑，一種是 TNP-ATP，P2X 受體1、2、3、4 亞型的拮抗劑;另一種是 PPADS，P2X 受體1、2、3、5、7 亞型的拮抗劑。結果發現TNP-ATP阻斷坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的機械痛敏，而PPADS則不能。這表明P2X4受體可能在坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的機械痛敏中起重要作用，見圖3。

3 阻斷P2X4受體抑制坐骨神經周圍給予rrTNF引起的脊髓背角TNF-α的上調

以前的研究發現，坐骨神經周圍給予rrTNF可引起脊髓背角TNF-α的上調［1］，那P2X4受體是否在坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的脊髓背角TNF-α的上調中發揮作用，因此我們也觀察了在坐骨神經周圍給予rrTNF的大鼠前鞘內應用TNP-ATP和PPADS后脊髓背角TNF-α的表達情況。結果發現，與對照組(鞘內應用NS)相比，TNP-ATP明顯抑制脊髓背角TNF-α的上調，而PPADS則不能。這表明P2X4受體可能通過上調脊髓背角的TNF-α在坐骨神經周圍給予rrTNF引起的機械痛敏中發揮重要作用，見圖4。

Figure 3.The effects of P2X4receptor on mechanical allodynia induced by peri-sciatic administration of rrTNF.The intrathecal injection of TNP-ATP completely blocked the mechanical allodynia throughout the course of the tests，whereas the intrathecal injection of PPADS in the same way did not.Upward and downward arrows indicate the time of rrTNF and drug administration，respectively.Mean±SEM.n=8.*P＜0.05 vs baseline(－1 d).圖3 P2X4受體在坐骨神經周圍給予rrTNF引起的機械痛敏中的作用

Figure 4.Blockage of P2X4receptor inhibited the upregulation of TNF-α induced by peri-sciatic administration of rrTNF in the spinal dorsal horn.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS.圖4 阻斷P2X4受體抑制坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的脊髓背角TNF-α的上調

討 論

目前的研究發現坐骨神經周圍給予rrTNF后同側脊髓背角P2X4受體的表達水平明顯升高，P2X4受體僅位于脊髓小膠質細胞。鞘內應用TNP-ATP可抑制坐骨神經周圍給予rrTNF誘導的機械痛敏和脊髓背角TNF-α的上調。這些結果表明坐骨神經周圍給予rrTNF后，通過小膠質細胞的P2X4受體使脊髓背角的TNF-α表達增加，這樣形成一個正反饋，引起大鼠后爪長達20 d的機械性痛閾下降和熱痛反應增強。

Tsuda等［3］發現:神經損傷后1 d，小膠質細胞內的P2X4受體上調;鞘內應用P2X4受體的反義寡核苷酸抑制受體的上調和神經損傷后的觸誘發痛。我們以前的結果顯示，ATP通過上調小膠質細胞P2X4受體的表達誘導脊髓背角的LTP［6］。目前的研究也取得類似結果，這表明神經損傷或坐骨神經周圍給予rrTNF后，胞外ATP可能釋放增加，作用于P2X4受體，從而增強脊髓背角的突觸傳遞，產生神經病理性疼痛。

TNF-α作為神經損傷和炎癥過程中最重要和最早釋放的致炎細胞因子，在神經纖維Wallerian變性和神經病理性疼痛的產生過程發揮重要作用［10］。在多種神經損傷引起病理性疼痛的動物模型中，TNF-α在脊髓背角和背根節的表達明顯升高，抑制TNF-α的合成或拮抗其受體可減輕神經病理性疼痛［2］。足底注射、皮下注射、坐骨神經內注射TNF-α均能夠誘導大鼠神經病理性疼痛癥狀［11-13］。我們目前的結果發現，坐骨神經周圍給予rrTNF可誘導大鼠機械痛敏和脊髓背角TNF-α的上調，P2X4受體參與此過程。Li等［14］的研究發現，缺氧誘導致炎細胞因子(TNF-α、IL-1β)的表達可被 TNP-ATP 所抑制，這表明P2X4受體可誘導致炎細胞因子的產生。我們最近的研究［15］發現坐骨神經周圍給予rrTNF可激活脊髓背角小膠質細胞的SFKs和p38，并通過SFKs/p38信號通路引起脊髓背角TNF-α的上調。因此，我們推測坐骨神經周圍給予rrTNF后，可能引起脊髓背角小膠質細胞P2X4受體的表達增加，P2X4受體通過小膠質細胞SFKs/p38信號通路使脊髓背角TNF-α的表達增加誘導大鼠產生機械痛敏。

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