ABCE1基因沉默對人膀胱癌T24細胞增殖和遷移能力的影響

李 強， 王九江， 羅水發， 朱俊杰

(寧波明州醫院泌尿外科，浙江寧波 315000)

膀胱癌是我國臨床泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，同時也是全身10大常見的腫瘤之一［1］。雖然化療和新輔助化療在膀胱癌的治療中已得到了廣泛的應用，但是膀胱癌的預后尤其是已發生臨床轉移和腫瘤復發的患者仍不十分理想［2］。研究表明多基因調控導致其表達產物改變是膀胱癌侵襲和轉移的機制之一［3］。近年來發現ATP結合盒轉運蛋白E亞族成員 1(ATP-binding cassette，sub-family E，member 1，ABCE1)在腫瘤發生、發展中發揮著重要的作用，ABCE1的異常表達可能與惡性腫瘤的增殖、轉移有關［3-4］。本研究通過RNA干擾技術沉默人膀胱癌T24細胞的ABCE1基因，探討其對膀胱癌細胞生物學行為的影響，為膀胱癌針對ABCE1基因的靶向治療提供了實驗基礎。

材料和方法

1 主要材料

人膀胱癌T24細胞株和胎牛血清(上海研晶生物科技有限公司);MI 1640培養液、胰蛋白酶(Gibco);脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen);RNA提取試劑Trizol(北京天根公司);cDNA合成試劑盒(TOYOBO);RT-PCR兩步法試劑盒(Promcga);siRNA片段(珠海英平生物技術有限公司構建);HRP標記的羊抗鼠IgG(Santa Cruz);鼠抗GAPDH單克隆抗體(上海微蒙生物科技有限公司);CCK-8(上海炎彬化工公司);550酶標儀(Bio-Rad);Matrigel(BD);流式細胞儀(Coulter);生物倒置顯微鏡(Olympus);ECL試劑盒(Thermo)。

2 方法

2.1 siRNA設計、合成及轉染 根據參考文獻［5］設計靶向人類 ABCE1的 siRNA序列，正義鏈為5’-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCTTAGCTTTTTTG-3’，反義鏈為5’-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGTACTCGCTGTAGCG-3’;陰性對照siRNA正義鏈為5’-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3’，反義鏈為 5’-AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCACAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3’;質粒由珠海英平生物技術有限公司構建。膀胱癌細胞株T24細胞培養于含10% 小牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2密閉式孵箱內培養、傳代，實驗時取對數生長期的細胞。按每孔2×105個將膀胱癌細胞株T24接種于6孔板中，當融合率達80%時以脂質體法進行轉染。轉染時分為3組:轉染 pGenesil-1-ABCE1-siRNA載體者為 T24/ABCE1-siRNA組(實驗組)，轉染NC siRNA載體者為T24/control組(即對照組)，未轉染的膀胱癌T24為T24組(即空白組)。于轉染后48 h進行RNA干擾效應的檢測。

2.2 RT-PCR檢測mRNA表達水平 T24棄培養液后，用PBS沖洗3次，采用TRIzol法提取細胞的總RNA，通過cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。分別擴增ABCE1和內參照GAPDH。ABCE1的上游引物為 5’-TTGGTTGTGGGAAGTCGT-3’，下游引物為5’-GCTTATGTAGTTAATGGGAGGT-3’(擴增產物為415 bp);GAPDH的上游引物為5’-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3’，下游引物為 5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’(擴增產物為185 bp)。PCR反應條件為95 ℃5 min;95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40個循環。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，紫外燈下觀察電泳結果，通過UVI凝膠成像系統攝像，Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值，用ABCE1/GAPDH為ABCE1的mRNA相對表達量。

2.3 Westem blot檢測ABCE1的蛋白水平 T24棄培養液后，以PBS沖洗3次，加入150 μL RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，于 99℃變性10 min。取 50 μg蛋白經 10%的 SDS-PAGE后，電轉移印跡于PVDF膜上，通過5% 的脫脂奶粉進行封閉，2 h后加入1∶1 000稀釋的ABCE1多克隆I抗，4℃過夜，TBST洗膜5 min 5次，加入1∶5 000 HRP標記的 II抗和GAPDH，于37℃孵育2 h。PBS洗滌，通過ECL法檢測。暗室曝光X光片，通過UVI凝膠成像系統攝像，Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值，以ABCE1/GAPDH為ABCE1的相對表達量。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期 收集3組T24細胞，調整細胞濃度至1.5×106/L，冷PBS洗滌2次，用70%的冷乙醇(4℃)進行細胞沉淀后混勻備用，洗滌細胞后，再用PBS調細胞濃度為1.5×106/L，與含50 mg/L RNA酶的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。以100 mg/L碘化丙啶行細胞DNA染色，暗室中放置1 h后，采用流式細胞儀分析各組T24細胞的DNA含量分布，并計算出每個周期細胞所占的百分率。

2.5 CCK-8法檢測細胞增殖 指數生長期T24細胞接種于96孔板，調整細胞密度每孔達到1×103，加入含10%胎牛血清DMEM培養基200 μL，每組設6個復孔，培養24 h后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，培養箱溫育4 h后，以不加細胞空白孔為對照，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度A值。以細胞的吸光度A值平均值為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。

2.6 細胞劃痕損傷實驗 在對數生長期將將上述3組T24細胞分別以每孔5×103個的密度接種于6孔板，待培養的各組細胞生長為細胞單層后，通過10 μL移液槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕。PBS輕柔洗滌，每孔加入2 mL不含胎牛血清的DMEM培養液繼續培養，于48 h后倒置顯微鏡100倍下觀察細胞遷移情況。

2.7 Transwell小室侵襲實驗 于聚碳酸酯微孔濾膜表面鋪Matrigel每孔50 μg，于聚合好的小室下室中加入10%的胎牛血清做條件培養液，在上室加入按上述3種細胞處理過的T24細胞懸液100 μL(細胞總數為3×105/L)，置于培養箱中24 h后取出，以棉簽小心刮除濾膜上室面未穿過的瘤細胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗3遍，蘇木精染色10 min，PBS沖洗小室，自然晾干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術刀片小心取下，通過樹脂膠固定于玻片上(膜內面朝上)后，封片;干燥后于200×光鏡下記數每膜上、下、左、右、中5個視野的侵襲細胞數，每組平行設3個小室，重復3次，計算平均值為細胞數。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件行統計學分析，以均數±標準差(mean±SD)表示計量資料，多組間連續變量比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 siRNA抑制ABCE1 mRNA的表達

ABCE1 mRNA表達的RT-PCR檢測與對照組和空白組比較，ABCE1-siRNA組條帶明顯變窄，與對照組和空白組比較，差異均有統計學意義(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Effect of ABCE1 gene silencing on the mRNA expression of ABCE1 in T24 cells detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control and blank.圖1 RT-PCR檢測T24細胞中ABCE1 mRNA的表達

2 siRNA抑制ABCE1蛋白的表達

與對照組和空白組比較，ABCE1-siRNA組蛋白條帶明顯變窄，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of ABCE1 gene silencing on the protein expression of ABCE1 in T24 cells detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs blank and control.圖2 Western blot檢測T24細胞中ABCE1的蛋白表達水平

3 ABCE1基因沉默對細胞周期的影響

流式細胞術檢測各組T24細胞的細胞周期，結果示ABCE1-siRNA組與對照組和空白組相比，在G0/G1期的細胞顯著增加，在S期細胞顯著減少。差異有統計學意義(P＜0.05)，M期細胞數未見明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05)。說明有明顯的S期阻滯，見表1。

4 ABCE1基因沉默對細胞增殖的影響

依CCK-8法檢測結果繪制的生長曲線示，ABCE1-siRNA組較對照組和空白組的曲線明顯降低(P ＜0.05)，見圖 3。

Figure 3.The growth curve of the T24 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs blank and control.圖3 ABCE1 siRNA對T24細胞生長的影響

5 細胞劃痕損傷實驗結果

48 h后ABCE1-siRNA組細胞劃痕愈合緩慢，而對照組和空白組細胞劃痕已基本長滿，見圖4。

6 ABCE1基因沉默對T24細胞體外侵襲力的影響

如圖5所示，對照組和空白組穿過濾膜的細胞數量較多，分別為 56.57 ±5.34 和 57.46 ±4.21，ABCE1-siRNA組穿膜細胞數明顯減少(P＜0.05)，實驗結果表明特異性干擾ABCE1基因表達可有效地降低T24細胞的侵襲力。

討 論

膀胱癌的發病率居我國男性泌尿生殖系統惡性腫瘤的第1位，50～69歲為高發年齡，是源自膀胱移行上皮細胞的惡性腫瘤。其具有較易復發、生物學行為復雜多變、易侵襲和轉移的特點［4-5］。膀胱癌細胞臨床上的遠處轉移是機體一個多因素、多階段、多步驟的復雜過程。腫瘤的發生、發展是一個多階段的逐步演變過程，細胞通過一系列進行性改變而向惡性方向進展［6］。這期間涉及多個基因的變化，既有原癌基因激活和高表達的發生，也包含抑癌基因及凋亡基因的失活，亦還涉及大量細胞周期調節基因功能的變化［7-9］。同時許多研究顯示在腫瘤演變向惡性發展過程中存在一種調控分子在控制這些基因的表達變化，進而影響腫瘤的發生發展。相關研究提示ABCE1基因就是這么一種新的“調控分子”，參與了腫瘤的形成和發展。

Figure 4.The results of wound-healing assay.圖4 細胞劃痕損傷實驗結果

ABCE1基因是ATP結合盒轉運蛋白E亞家族的成員之一，定位于常染色體的4q31上，編碼核糖核酸酶 L(ribonuclease L，RNase L)抑制因子［10］，具有高度的保守性。該蛋白可以阻斷干擾素介導的細胞抗病毒2-5A/RNase L的通路，抑制細胞的凋亡過程，并能夠在促進蛋白質合成及細胞增殖分化方面發揮作用［11］。有研究表明，在腫瘤細胞系中抑制ABCE1的表達可明顯阻礙腫瘤細胞的生長［12-13］，提示ABCEl的表達與腫瘤細胞的發生、發展密切相關，理論上阻斷腫瘤細胞中ABCE1的表達可起到治療腫瘤的作用。

Figure 5.The results of Transwell invasion assay.圖5 Transwell小室侵襲實驗結果

越來越多的證據表明，ABCE1與腫瘤細胞的生長調控和遷移侵襲密切相關。為了研究ABCE1基因在膀胱癌細胞遷移中的具體作用，本研究使用RNA干擾技術沉默了膀胱癌T24細胞ABCE1基因的表達后，細胞的生長速度明顯減慢，遷移能力顯著下降，ABCE1基因沉默后S期細胞數明顯減少，細胞被阻滯在G0/G1期。同時劃痕實驗和小室侵襲實驗表明ABCE1基因沉默后膀胱癌T24細胞的遷移能力和侵襲能力降低。與Zhao等［14］對肺癌95-D/NCI-H446細胞的研究結果相同。

總之，ABCE1基因不僅與膀胱癌細胞的遷移能力和侵襲能力變密切相關，而且在促進膀胱癌細胞增殖方面也起著重要作用。特異性干擾ABCE1基因表達能夠抑制膀胱癌T24細胞的遷移能力，并抑制腫瘤細胞的增殖，因此，ABCE1的siRNA序列可能成為治療膀胱癌的有效靶點。干預ABCE1可能會為臨床膀胱癌等惡性腫瘤的治療提供新的思路。

［1］ 錦 輝.膀胱灌注不同化療藥物對預防淺表性膀胱癌術后復發的臨床分析［J］.國際泌尿系統雜志，2013，33(4):574-576.

［2］ 毛健偉，李慶文.肌層浸潤性膀胱癌的治療進展［J］.中華全科醫學，2013，11(5):778-780.

［3］ Brausi M，Collette L，Kuah K，et a1.Variability in the recurrence rate at first follow-up cystoscopy after TUR in stage transitional cell carcinoma of the bladder:a combined analysis of seven EORTC studies［J］.Eur Urol，2002，41(5):523-531.

［4］ 任 翼，劉永煜，劉德貴，等.RNA干擾介導ABCE1基因沉默對人肺腺癌A549細胞增殖的影響［J］.遼寧醫學雜志，2010，24(1):22-25.

［5］ 鄭毛根，田大力，黃 波.ABCE1基因siRNA表達質粒的構建及鑒定［J］.中國醫科大學學報，2007，36(6):697-699.

［6］ 歐陽高亮，李祺福.細胞凋亡與腫瘤的發生發展和治療［J］.國外醫學:腫瘤學分冊，2000，27(5):266-269.

［7］ Itoh Y，Ishikawa M，Kitaguchi R，et al.Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown［J］.Bioorg Med Chem，2011，19(10):3229-3241.

［8］ 李小瑞，岳軍艷，張清琴，等.沉默ABCE1基因對人食管癌EC109細胞凋亡、增殖、侵襲及遷移的影響［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2013，20(5):569-573.

［9］ 陳 紅，謝 麗，劉寶瑞.MDM2作為腫瘤標志物的研究進展［J］.臨床腫瘤學雜志，2011，16(8):751-754.

［10］ Aritoshi I，Susumu S，Akihiro S，et al.Catalog of 605 single-nucleotide polymorphisms(SNPs)among 13 genes encoding human ATP-binding cassette transporters:ABCA4， ABCA7， ABCA8， ABCD1， ABCD3， ABCD4，ABCE1，ABCF1，ABCG1，ABCG2，ABCG4，ABCG5，and ABCG8［J］.J Hum Genet，2002，47(6):285-310

［11］ Vander D，Elisabeth GE，Wim T，et al.ATP-binding cassette(ABC)transporters in normal and pathological lung［J］.Respir Res，2005，6:59.

［12］ Zheng MG，Gao Y，Huang B，et al.Suppression of ABCE1 leads to decreased cell proliferation and increased apoptosis in 95-D/NCI-H446 lung carcinoma cells［J］.Prog Biochem Biophys，2009，36(11):1475-1482.

［13］ 黃 波，王曉東，郎賢平.ABCE1基因對小細胞肺癌增殖、侵襲、遷移能力的影響［J］.中國老年學雜志，2013，33(1):119-122.

［14］ Zhao AJ，Zheng MG，Wang GC，et al.Silencing ABCE1 increases E-cadherin expression and decreases cell invasion in 95-D/NCI-H 446 lung carcinoma cells［J］.Prog Biochem Biophys，2010，37(8):891-896.