濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏治療慢性難愈合創面的超微病理及絲裂原活化蛋白激酶激酶和c-myc mRNA表達的機制研究

唐乾利，黃　欣，王　宇，何曉微，王　兵，黃許森，李　輝，金　萌，呂　震

濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏治療慢性難愈合創面的超微病理及絲裂原活化蛋白激酶激酶和c-myc mRNA表達的機制研究

唐乾利，黃欣，王宇，何曉微，王兵，黃許森，李輝，金萌，呂震

目的 探討濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏（MEBT/MEBO）治療慢性難愈合創面的超微病理及絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）、c-myc mRNA表達的機制。方法 選取SPF級雄性SD大鼠80只，采用隨機數字表法將其分為空白對照組、模型組、濕潤燒傷膏組、康復新液組，每組20只。空白對照組建立全層皮膚缺損開放性創面，模型組、濕潤燒傷膏組、康復新液組建立全層皮膚難愈合創面。空白對照組建立創面后不做其他處理，模型組外敷0.9%氯化鈉溶液，濕潤燒傷膏組外敷MEBO，康復新液組外噴康復新液。在用藥后第3、6、12天利用透射電鏡觀察大鼠皮膚創面細胞超微結構；用藥后第12天進行熒光定量聚合酶鏈反應 （RT-PCR），分析MAPKK、c-myc mRNA的表達水平。結果 用藥后第3、6、12天，濕潤燒傷膏組與康復新液組細胞結構逐步改善，各細胞器形態結構逐漸恢復至正常水平。4組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義 （P＜0.05）。模型組、濕潤燒傷膏組與康復新液組較空白對照組MAPKK、c-myc mRNA表達水平降低，濕潤燒傷膏組、康復新液組較模型組MAPKK、c-myc mRNA表達水平均增高（P＜0.05）；濕潤燒傷膏組與康復新液組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）。結論 MEBT/MEBO能夠改善細胞超微病理結構，提高MAPKK、c-myc mRNA的表達水平，促進慢性難愈合創面恢復。

慢性難愈合創面；濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏；病理學；絲裂原活化蛋白激酶激酶；c-myc

唐乾利，黃欣，王宇，等.濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏治療慢性難愈合創面的超微病理及絲裂原活化蛋白激酶激酶和c-myc mRNA表達的機制研究［J］.中國全科醫學，2015，18（3）：294-299.［www.chinagp.net］

Tang QL，Huang X，Wang Y，et al.Ultrastructural pathology and the mechanism of expression of MAPKK mRNA&c-myc mRNA of chronic refractory wound treated by MEBT/MEBO［J］.Chinese General Practice，2015，18（3）：294-299.

同行評議：

本研究從細胞超微結構及分子生物學水平研究MEBT/MEBO治療皮膚慢性難愈合創面的修復機制。通過建立慢性難愈合創面大鼠模型，觀察MEBT/MEBO在治療過程中對細胞結構及功能的改變，同時觀察 MEBT/MEBO對MAPKK、c-myc mRNA表達的改變情況，確定了MEBT/MEBO治療慢性難愈合創面的部分作用，為今后深入探討慢性難愈合創面的修復機制提供了可能的參考指標。同時，本研究進一步豐富和發展了燒傷濕性醫療技術，為開發MEBT/MEBO新的臨床適應證進一步提供了實驗依據和理論依據。

皮膚慢性難愈合創面在臨床上多指局部皮膚或皮下組織受到損傷，伴有各種原因刺激導致的限局性缺損、潰爛，經1個月以上治療未能愈合，也無愈合傾向。皮膚再生醫療技術主要為濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏（MEBT/MEBO）［1］，其能夠加快皮膚慢性難愈合創面的修復，刺激血管內皮細胞生長因子的分泌，促進成纖維細胞生長因子的釋放和新生毛細血管的生長，減少創面炎性滲出，提高創面愈合質量［2］。絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）可通過激活p38、ERK、JNK等信號通路，參與細胞的各種應答，特別是皮膚損傷愈合過程中的基因表達［3］。其可防止細胞周期停滯，增強細胞內外信息的交流，促進成纖維細胞和血管內皮細胞的生長，還能使表皮基底層細胞增殖、遷移，繼而促進細胞增殖分化，防止細胞凋亡［4］。c-myc mRNA是MAPKK重要的下游底物，其高表達能促進組織細胞增殖，有積極的生物學意義，有利于損傷創面的修復，恢復皮膚組織的生理功能，并促進創緣處成纖維細胞、血管內皮細胞、皮膚附屬上皮細胞增殖組織旺盛修復［5-6］。本研究擬運用超微電鏡、熒光定量聚合酶鏈反應 （RT-PCR），觀察不同時間段創面的愈合情況，并從基因水平分析慢性難愈合創面的愈合機制，探討MEBT/MEBO促進慢性難愈合創面修復的機制，為臨床推廣應用MEBT/MEBO防治慢性難愈合創面提供可靠的理論依據和研究思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級雄性SD大鼠80只，2月齡，體質量為200～250 g（廣西醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK桂2011-0001）。大鼠飼養于安靜動物房中（噪聲85分貝以下），環境溫度保持在

18～26℃，相對濕度40% ～70%，自由進食和飲水，定期更換墊料。所有大鼠適應周圍環境1周后進行實驗。

1.2藥品與試劑 美寶濕潤燒傷膏（北京光明中醫燒傷創瘍研究所汕頭經濟特區美寶制藥廠生產，國藥準字：Z20000004），康復新液 （湖南科倫制藥有限公司生產，國藥準字：Z43020995），鹽酸氯胺酮 （江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，國藥準字：H32022820），醋酸氫化可的松（上海通用藥業股份有限公司生產，國藥準字：H31021290），總RNA提取試劑盒（北京天根生物有限公司提供，編號：FP205-01），Real Master Mix SYBR Green（北京天根生物有限公司提供，目錄號：DP419），TaKaRa試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司提供，Code：DRR037A〕。

1.3方法

1.3.1分組與模型的建立 將80只雄性SD大鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、模型組、濕潤燒傷膏組、康復新液組，每組 20只。大鼠均參照趙就禹等［7］研究在大鼠腰椎部建立直徑約為24 mm的圓形全層皮膚缺損開放性創面模型。除空白對照組外，其余3組大鼠立即于右下腹部連續3 d肌肉注射80 mg/kg醋酸氫化可的松，建立慢性難愈合創面模型。

1.3.2換藥方法 模型組按創面大小外敷單層0.9%氯化鈉溶液紗布；濕潤燒傷膏組以MEBO藥膏直接涂抹于創面上，厚度約1 mm，再用濕潤燒傷膏浸透的單層紗布按創面大小外敷于創面；康復新液組創面外噴康復新液，而后以康復新液浸透后的單層紗布按創面大小外敷于創面。模型組、濕潤燒傷膏組、康復新液組大鼠均在創面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定，

每日定時換藥2次，連續12 d，且大鼠均于換藥首日起連續4 d腹腔注射青霉素80 000 U/d。空白對照組不做其他處理。

1.3.3超微結構檢測 在用藥后第3、6、12天，大鼠均切取相同部位大小約為1 mm×1 mm×1 mm的皮膚組織，用醋酸鈾染色法制作成超微病理切片，利用透射電鏡（廣西醫科大學動物實驗中心提供，型號：日立H-7650），在30 000倍數下觀察大鼠皮膚創面細胞內細胞器的形態結構。

1.3.4RT-PCR檢測 在用藥后第12天，大鼠均取相同部位的皮膚組織，深度以達到真皮全層為宜，沿皮面平行切下皮膚組織，進行RT-PCR檢測；以β-actin為內參基因，根據CT值計算MAPKK及c-myc mRNA的表達水平，采用熒光相對定量分析法計算結果。

1.4統計學方法 數據的整理和分析采用SPSS 19.0統計學軟件，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK-q檢驗，以 P ＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1超微病理結構

2.1.1用藥第3天皮膚組織超微病理學情況 用藥第3天，空白對照組細胞核呈梭形，核內物質散亂，大量線粒體內無線粒體脊（見圖1A）。模型組細胞核未成型，體積變小，核周隙增寬，可見大量空泡 （見圖1B）。濕潤燒傷膏組出現核仁壞死，核周隙增寬；胞質溶解明顯；內質網擴張，排列紊亂；線粒體嵴被破壞，線粒體內有空泡（見圖1C）。康復新液組出現細胞核核周隙凹凸不平，伴有線粒體融合，線粒體數量減少，內質網擴張，且內質網色澤暗淡，存在粗面內質網脫顆粒現象（見圖1D）。

2.1.2用藥第6天皮膚組織超微病理學情況 用藥第6天，空白對照組細胞核清晰明顯，形態圓潤，未出現線粒體成片聚集融合現象；胞質中可見大量內質網貫穿其中（見圖2A）。模型組細胞核破壞嚴重，呈異常的梭形結構，核內物質散亂；部分內質網擴張，并伴有大量線粒體成片聚集、擠壓，形成網狀或梭形結構（見圖2B）。濕潤燒傷膏組可見結構完整的高爾基體，扁平膜囊、大囊泡、小囊泡；線粒體形態結構完整，可見數條線粒體嵴（見圖2C）。康復新液組細胞結構修復十分明顯，可見全視野內大量管狀內質網分布，形成網織狀結構（見圖2D）。

2.1.3用藥第12天皮膚組織超微病理學情況 用藥第12天，空白對照組細胞核形態完整，核仁清晰，內質網能觀察到片層隙狀或小管狀結構，并貫穿于線粒體之間（見圖3A）。模型組細胞核仍未成形，核內物質溶解消失；線粒體數量仍然稀少，但部分線粒體可見少量線粒體嵴垂直排列在線粒體內膜上；內質網數量稀少（見圖3B）。濕潤燒傷膏組的細胞結構發育良好，可見大量高爾基體，結構完整，由數個扁平囊泡堆積而呈現出弓形或半球形；粗面內質網上附著大量核糖體，無脫顆粒現象（見圖3C）。康復新液組細胞結構發育良好，可觀察到大量粗面內質網和高爾基體生成，大量扁平囊泡聚集呈長條梭形結構（見圖3D）。

2.2RT-PCR檢測結果的比較

2.2.1擴增曲線、溶解曲線 在用藥后第12天，對各組大鼠MAPKK、c-myc mRNA進行RT-PCR測定，分別得出擴增曲線、溶解曲線。擴增曲線的基數期均穩定在同一水平，CT值穩定在10～30之間，拐點清晰，整體平行性良好，溶解曲線平穩，溶解峰呈單峰，擴增產物有效，未見異常雙峰（見圖4～7）。

2.2.24組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較 4 組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。模型組、濕潤燒傷膏組、康復新液組較空白對照組MAPKK、c-myc mRNA表達水平降低，差異有統計學意義 （P＜0.05）；濕潤燒傷膏組、康復新液組較模型組MAPKK、c-myc mRNA表達水平均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；濕潤燒傷膏組與康復新液組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較，差異無統計學意義 （P＞0.05，見表1）。

圖4　MAPKK mRNA擴增曲線Figure 4 MAPKK mRNA amplification curve

圖1　用藥第3天皮膚組織超微病理結構　（醋酸鈾染色法，×30 000）Figure 1 Cellular ultrastructural pathology of the skin wound on day 3

　圖2 用藥第6天皮膚組織超微病理結構　（醋酸鈾染色法，×30 000）Figure 2 Cellular ultrastructural pathology of the skin wound on day 6

圖3　用藥第12天皮膚組織超微病理結構　（醋酸鈾染色法，×30 000）Figure 3 Cellular ultrastructural pathology of the skin wound on day 12

表1　4組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較 （±s）Table 1 Comparison of the expression level of MAPKK，c-myc mRNA among the four groups

表1　4組MAPKK、c-myc mRNA表達水平比較 （±s）Table 1 Comparison of the expression level of MAPKK，c-myc mRNA among the four groups

注：MAPKK=絲裂原活化蛋白激酶激酶；與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別　例數20　0.89±0.17　0.86±0.24模型組　20　0.15±0.07*　0.18±0.05*濕潤燒傷膏組　20　0.65±0.11△　0.44±0.07*△康復新液組　20　0.63±0.13△　0.42±0.08*△F值MAPKK mRNA　c-myc mRNA空白對照組＜0.001　＜0.001 117.811　86.054 P值

圖5　MAPKK mRNA溶解曲線Figure 5 MAPKK mRNA dissociation curve

圖6　c-myc mRNA擴增曲線Figure 6 c-myc mRNA amplification curve

圖7　c-myc mRNA溶解曲線Figure 7 c-myc mRNA dissociation curve

3　討論

皮膚慢性難愈合創面在臨床上是一種常見的周圍血管性疾病，具有病因復雜、患病時間長、病情反復發作、愈后極易復發的特點［8］。皮膚慢性難愈合創面愈合的關鍵主要在于增強局部細胞免疫功能［9］，減少或消除炎性反應［10］，以完成對創面的上皮化再生修復［11］。對細胞超微形態結構和創傷修復相關信號通路的研究能反映出在創傷修復過程中細胞增殖、分化、代謝及死亡諸多方面的表現和調控方式，對揭示機體損傷修復與再生的機制具有重要意義。

本研究皮膚組織超微病理結構顯示，MEBT/MEBO能促進細胞內環境的穩定，逐步改善損傷細胞的超微病理結構。盡管用藥后第3天，各組細胞超微病理結構變化不明顯，細胞器仍存在一定的損傷；但是從用藥后第6天開始，濕潤燒傷膏組大量線粒體的超微結構恢復正常，康復新液組則出現數量眾多的粗面內質網；特別在用藥后第12天，濕潤燒傷膏組大鼠的細胞器超微結構基本恢復，說明MEBT/MEBO能保護細胞核的結構完整及線粒體膜的完整性，改善因病理因素破壞而導致的內質網和高爾基體的氧化應激狀態，重建核仁并促進大小亞基的協調能動性，防止細胞凋亡，促進細胞超微結構恢復正常［12］。值得關注的是，MEBT/MEBO在改善損傷細胞的超微病理結構過程中，由于細胞器結構功能恢復正常，同時也能促進大鼠潰瘍創面成纖維細胞的增殖，促進新生毛細血管的形成，有效地改善創面局部炎癥，加快肉芽組織的生長，從而促進創面的修復［13］。

MAPKK mRNA在參與傷口的愈合過程中發揮了重要作用，能調節細胞免疫，清除過多的中性粒細胞，誘導堿性成纖維細胞、血管內皮細胞等的合成與分泌，調控細胞凋亡［14］。c-myc mRNA是MAPKK mRNA的主要下游底物，可調節細胞周期，啟動細胞增殖，抑制細胞分化，調控細胞凋亡，并在核內傳遞信息，具有轉錄因子活性的作用［15］。本研究中RT-PCR的檢測結果顯示，濕潤燒傷膏組、康復新液組較模型組的 MAPKK、c-myc mRNA表達水平增高，說明MEBT/MEBO能提高MAPKK、c-myc mRNA的表達水平，通過調控MAPKK、c-myc mRNA的傳導信號通路，使干細胞在原位持續分裂再生，有效改善創面局部的微環境，完成潰瘍創面的愈合。

總之，本研究結果顯示MEBT/MEBO能明顯改善SD雄性大鼠表皮生長細胞超微結構，穩定細胞內環境，提高潰瘍創面中 MAPKK、c-myc mRNA的表達水平，調控細胞生長效應，加速成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖分化，該改變可能是MEBT/MEBO促進大鼠慢性難愈合創面恢復的作用機制之一，將為今后深入探討慢性難愈合創面的機制研究提供可能的參考指標。本實驗僅研究了用藥后第12天MEBT/MEBO對MAPKK、c-myc mRNA表達水平改變情況的影響，尚缺乏對這些指標在整個創面愈合過程中的動態觀察。經MEBT/MEBO治療后，對大鼠慢性難愈合創面的恢復具有明顯的效果，但停止用藥治療后，創面能否保持正常還有待在今后的研究中繼續觀察。

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（本文編輯：李婷婷）

Ultrastructural Pathology and the Mechanism of Expression of MAPKK mRNA&c-myc mRNA of Chronic RefractoryWound Treated by MEBT/MEBO

TANG Qian-li，HUANG Xin，WANG Yu，et al.Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

Objective To study the ultrastructural pathology and the mechanism of expression of MAPKK mRNA&c -myc mRNA of chronic refractory ulcer wound treated by MEBT/MEBO.Methods A total of 80 SPF male SD rats were randomly divided into four groups by random number table method：blank control group，model group，MEBO ointment group and new healing lotion group，20 rats in each group.The full-thickness skin defect open wound was established among rats in blank control group，full-thickness skin refractory ulcer wound was established among rats in model group，MEBO ointment group and new healing lotion group.After the establishment of wound，rats in blank control group were not managed，rats in model group were dressed with normal saline，rats in MEBO ointment group were dressed with MEBO，rats in new healing lotion group were sprayed with new healing lotion.3，6，12 days after treatment，the cellular ultrastructural structure of the skin wound was observed using TEM microscope.12 days after treatment，the expression levels of MAPKK mRNA and c-myc mRNA using RT-PCR technology.Results 3，6 and 12 days after treatment，the cellular ultrastructural structure of the skin wound among rats in MEBO ointment group and new healing lotion group gradually improved，morphology and structure of cell organs restored tonormal.There were significant differences in expression levels of MAPKK mRNA and c-myc mRNA among four groups（P＜0.05）.The expression levels of MAPKK mRNA and c-myc mRNA in model group，MEBO ointment group and new healing lotion group were significantly lower than those in blank control group，respectively；while the expression levels of MAPKK mRNA and c-myc mRNA in MEBO ointment group and new healing lotion group were significantly higher than those in model group，respectively（P＜0.05）.There was no significant difference in expression levels of MAPKK mRNA and c-myc mRNA between MEBO ointment group and new healing lotion group（P＞0.05）.Conclusion MEBT/MEBO can improve cellular pathological ultrastructure，increase the expression levels of MAPKK mRNA and c-myc mRNA，and promote chronic refractory ulcer wound healing.

Chronic Refractory Ulcer；MEBT/MEBO；Pathology；MAPKK；c-myc

R 644

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.03.013

國家自然科學基金資助項目（81360547）；廣西自然科學基金資助項目（2013GXNSFDA019020）

533000廣西百色市，右江民族醫學院（唐乾利，王宇，王兵，黃許森，李輝，金萌，呂震）；廣西中醫藥大學 （黃欣，何曉微，王兵，李輝，金萌，呂震）

唐乾利，533000廣西百色市，右江民族醫學院；E-mail：tangqianliyy@126.com

2014-07-21；

2014-11-21）