磷酸化蛋白質組學鑒定PTPLAD1調控的結腸癌細胞酪氨酸磷酸化蛋白質*

胡陽，楊杰，余汝媛，汪洋(暨南大學生命科學技術學院，功能蛋白質研究廣東普通高校重點實驗室，廣東廣州510632)

磷酸化蛋白質組學鑒定PTPLAD1調控的結腸癌細胞酪氨酸磷酸化蛋白質*

胡陽，楊杰，余汝媛，汪洋△
(暨南大學生命科學技術學院，功能蛋白質研究廣東普通高校重點實驗室，廣東廣州510632)

目的:用磷酸化蛋白質組學的方法鑒定并分析結腸癌細胞中含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結構域蛋白1(PTPLAD1)調控的酪氨酸磷酸化蛋白。方法:運用siRNA技術沉默PTPLAD1的表達，于細胞培養條件下運用氨基酸穩定同位素標記技術(stable lsotope labelingwith amino acids in cell culture，SILAC)標記細胞，用酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白，用LTQ-OrbitrapXL質譜鑒定因敲低PTPLAD1所出現的差異表達的酪氨酸磷酸化蛋白，進一步利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件對這些差異蛋白進行生物信息學分析。結果:用real-time PCR篩選得到有效的siRNA干擾片段，Western blot驗證其干擾效果及有效干擾時間。質譜鑒定PTPLAD1調控的差異酪氨酸磷酸化蛋白共20個，其中顯著上調的8個，顯著下調的10個，主要為轉錄因子及腫瘤標志物相關蛋白。IPA軟件的結果表明PTPLAD1調控的差異酪氨酸磷酸化蛋白的功能主要與器官發育分化、維持組織分化類型及細胞凋亡、增殖相關。結論:成功鑒定出PTPLAD1調控的差異酪氨酸磷酸化蛋白，可以為后續研究PTPLAD1在結腸癌的發生發展中的作用及機理提供基礎。

含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結構域蛋白1;HCT-116細胞;小干擾RNA;氨基酸穩定同位素標記技術;磷酸化蛋白質組學

［ABSTRACT］AIM:To identify and analyze tyrosine-phosphorylated proteins regulated by protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1(PTPLAD1)in colon cancer cells by phosphoproteomics.METHODS:The expression of PTPLAD1 in colon cancer cell line HCT-116 was knocked down by small interfering RNAs，and the differential expression of tyrosine-phosphorylated proteins in response to the konckdown of PTPLAD1 in HCT-116 cellswas identified by stable isotope labeling with amino acid in cell culture(SILAC)，coupled with the tyrosine phosphorylation antibody immunoprecipitation and LC-MS/MSanalysis.The Ingenuity Pathway Analysis(IPA)softwarewas employed for bioinformatics analysis on the differentially-expressed proteins.RESULTS:A total of20 differentially-expressed tyrosine-phosphorylated proteins were identified by MS，including 8 markedly up-regulated and 10 evidently down-regulated proteins.IPA software suggested that these proteinsweremainly associated with the disease of cancer，tissue development and function，and cell death and survival.CONCLUSION:We successfully identified PTPLAD1-regulated differentially-expressed tyrosinephosphorylated proteins in colon cancer cell line HCT-116.Our analysis suggests that PTPLAD1-regulated proteins in colon cancer are closely correlated with colon cancer.

［KEY WORDS］Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1;HCT-116 cells;Small interfering RNA;Stable isotope labeling with amino acid;Phosphoproteomics

腸癌在全球發病率高居第三，在消化道類腫瘤中的發病率僅次于胃癌。到目前為止，已知的致癌基因中有3/4是酪氨酸激酶介導的，因而更多的關注投向了對酪氨酸激酶的研究［1］。人類中已經研究較為清楚的編碼蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)家族的基因有107個，它們在調控細胞生理和病理進程的許多方面發揮重要作用，而且具有一些重要的結構特征，如特征序列(H/V)C (X)5R(S/T)組成的活性部位和外部常見環狀結構，是它們發揮催化作用的重要結構基礎［2］。

含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結構域蛋白1(protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1，PTPLAD1)是屬HACD極長鏈脂肪酸脫水蛋白家族成員，在哺乳類動物體內3-羥酰輔酶A氧化還原酶有4種同工酶，PTPLAD1(HACD3)分子即為其中的1種［3］。由于PTPLAD1含有與PTPs標志性催化活性位點非常類似的氨基酸序列(H/V)C(X)5R(S/ T)，它可能與PTPs具有相似的信號調節功能。目前關于PTPLAD1在機體中的作用報道較少，主要集中在紅細胞分化及丙型肝炎病毒復制方面［4-5］，我們前期的實驗結果表明PTPLAD1在結腸癌中是低表達的。為了進一步研究其分子機理，我們用蛋白質組學分析方法研究蛋白質磷酸化修飾，可以從整體上觀察細胞或組織中磷酸化修飾的狀態及其變化，即所謂磷酸化蛋白質組學［6-7］。本研究通過siRNA技術沉默PTPLAD1的表達，利用細胞培養條件下的氨基酸穩定同位素標記(stable isotope labelingwith amino acid in cell culture，SILAC)定量蛋白質組學結合免疫共沉淀富集技術，鑒定了PTPLAD1差異調控的酪氨酸磷酸化蛋白及這些蛋白磷酸化位點，進一步對這些差異酪氨酸磷酸化蛋白進行生物信息學分析，從而揭示PTPLAD1在結腸癌細胞HCT-116中調控酪氨酸磷酸化蛋白變化的情況，并分析其參與的信號通路。

材料和方法

1主要試劑

人結腸腺癌細胞系HCT-116購自中國科學院上海細胞庫;siRNA干擾片段合成購自GenePharma;轉染試劑Lipofectamine iMAX購自Invitrogen;胎牛血清和基本細胞液體培養基和胎牛血清購自Gibco; TRIzol?Reagent購自Life Technologies;逆轉錄試劑購自TaKaRa;BCA法蛋白濃度測定試劑盒和SILAC試劑盒為Pierce產品;IP裂解液和RIPA裂解液(強)購自碧云天公司;磷酸酶和蛋白酶抑制劑(Cocktail)購自Roche;PTPLAD1鼠單抗購自Abcam;Phospho-Tyrosine鼠單抗購自Cell Signaling;Protein A/G PLUS-Agarose購自Santa Cruz;actin抗體和胰蛋白酶為Promega產品;引物由Invitrogen設計合成，見表1。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1 Sequences of real-time PCR primers

2主要儀器

倒置顯微鏡(Nikon);蛋白電轉儀和real-time PCR儀為Bio-Rad產品;酶標儀(BioTek);流式細胞儀(Becton Dickinson);LTQ Orbitrap XL組合式質譜(Thermo);CO2細胞培養箱(Heal Force);超凈工作臺為江蘇蘇凈安泰公司產品;小型高速冷凍離心機(Eppendorf);純水系統(Millipore)。

3主要方法

3.1細胞培養、PTPLAD1序列同源性比對及其干擾片段設計將結腸癌HCT-116細胞接種于6孔板中，用含有10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基，置于5%CO2、37℃、100%濕度的細胞培養箱中培養。將PTPLAD1蛋白進行NCBIBLAST在線同源序列比對分析，PTPLAD1 siRNA序列根據GenScript公司網上設計系統進行設計，由蘇州吉瑪生物公司合成了3對PTPLAD1基因的干擾片段，見表2。

表2　si-PTPLAD1干擾片段序列Table 2.Sequences of si-PTPLAD1

3.2RNAi沉默PTPLAD1基因表達

3.2.1流式細胞術檢測干擾效率待細胞處于對數生長期時，用Lipofectamine iMAX脂質體，分別轉染si-PTPLAD1(3對)、熒光標記si-FAM和陰性對照(negative control，NC)siRNA(si-NC)，轉染24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察si-FAM轉染情況，并分別收集熒光標記的si-FAM和si-NC組細胞，通過C6 Flow Cytometer System檢測siRNA的轉染效率。

3.2.2Real-time PCR篩選PTPLAD1有效干擾片段將這3種干擾片段轉染到HCT-116細胞，24～48 h后提取細胞總RNA反轉錄為cDNA，real-time PCR檢測3種干擾片段的干擾效果。

3.2.3Western blot確定有效干擾時間在HCT-116中轉染有效的si-PTPLAD1片段，0 h、24 h、48 h和72 h后，收取不同時點的細胞，提取總蛋白，用BCA法測蛋白濃度定量后，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮5 min，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，將膜與Ⅰ抗(鼠抗人PTPLAD1抗體1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗膜，再與兔抗鼠HRPⅡ抗在室溫下孵育1 h，PBST洗膜，將膜與ECL發光底物結合，曝光，顯影。

3.3酪氨酸磷酸化蛋白的富集及其定量蛋白組學

3.3.1SILAC標記HCT-116細胞將50 mg［13C6］L-lysine-2HCl(重)和50 mg L-arginine-HCl(輕)徹底溶解于1 mL培養基。將溶解的氨基酸加入到含10%胎牛血清的500 mL培養基，加入青霉素和鏈霉素至終濃度100 mg/L，徹底混合均勻，用0.22μm的濾膜過濾除菌，在瓶上標記“重”。重復上述步驟再配制輕鏈標記的培養基。配制好的SILAC培養基4℃避光保存，并于6個月內使用。用SILAC培養基對HCT-116進行穩定同位素標記HCT-116(heavy)和HCT-116(light)，標記完全后(7代)取對數生長期細胞進行實驗。

3.3.2免疫共沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白及定量蛋白質組學實驗組si-PTPLAD1干擾重鏈標記的HCT-116(heavy)，對照組si-NC干擾輕鏈標記的HCT-116(light)，24 h后用胰酶消化收集細胞，用IP裂解液分別裂解實驗組及對照組細胞，BCA法測蛋白濃度，輕重鏈蛋白進行等量混合后，用鼠IgG及瓊脂糖珠子洗蛋白裂解液去除非特異結合蛋白，加入抗酪氨酸磷酸化抗體4℃旋轉孵育過夜，再加入瓊脂糖珠子4℃孵育4 h，洗珠子去除非特異性結合蛋白，行SDS-PAGE，銀染，將銀染條帶進行切割分成40等份，脫色，蛋白質還原烷基化，胰蛋白酶膠內酶解，肽段萃取、凍干，然后多肽通過液相色譜偶聯LTQ-Orbitrap XL分析，質譜數據經Max Quant軟件處理得到差異蛋白，Ingenity Pathway Analysis(IPA)軟件對差異蛋白數據進行生物信息學分析。

4統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1PTPLAD1蛋白結構及功能分析

在之前的研究中，我們發現PTPLAD1在結腸癌中是低表達的，為了進一步揭示該蛋白的功能，我們首先通過NCBIBLAST對PTPLAD1蛋白362個氨基酸序列進行同源比對分析，發現PTPLAD1主要含有2個結構域，如圖1所示，前1～125個氨基酸具有與p23相似的結構域，而p23是作為HSP90的輔助分子伴侶發揮功能的，對細胞內的調控因子和信號蛋白具有調控作用。后196～362結構域屬于PTPLA超家族，而PTPLA蛋白家族含有典型的PTPs標志性催化活性位點(H/V)C(X)5R(S/T)。PTPLA主要參與發育、分化及維持組織分化類型，于是我們推測PTPLAD1具有PTPs的功能，并且可能在腫瘤發生中扮演著重要的角色。

Figure 1.Structure and functional domains of PTPLAD1.The former region of PTPLAD1 is homologouswith p23，and its latter region belongs to PTPLA superfamily.圖1　PTPLAD1蛋白結構及功能分析

2RNAi沉默PTPLAD1基因表達

為進一步研究PTPLAD1在腫瘤中的抑制作用，我們運用RNA干擾技術，在結腸癌細胞HCT-116中敲低PTPLAD1來探索細胞的磷酸化蛋白變化情況。首先我們用倒置熒光顯微鏡觀察到si-FAM成功轉染到HCT-116細胞中，細胞發綠色熒光，流式細胞術檢測細胞轉染siRNA(si-FAM)的效率達90%以上。Real-time PCR篩選有效的si-PTPLAD1，發現編號為418和1045這2種干擾片段效果較好，Western blot實驗表明成功干擾PTPLAD1基因的表達及在24 h干擾效果較好，見圖2。

Figure 2.PTPLAD1 knockdown by siRNA in HCT-116 cell line.A:carboxyfluorescein-labelled siRNA(si-FAM)in the transfected cancer cells were observed under inverted fluorescent contrast-phasemicroscope(×200);B:the efficiency of RNA interference in colon cancer cellswas detected by flow cytometry;C:the effectiveness of the interference fragments of PTPLAD1 (si-418，si-710 and si-1045)was evaluated;D:Western blot analysis of PTPLDA1 in HCT-116 cells after knockdown of PTPLAD1 by siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.圖2　結腸癌細胞HCT-116中siRNA高效沉默PTPLAD1基因表達

3免疫共沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白及定量蛋白質組學研究PTPLAD1調控的磷酸化組學變化

PTPLAD1具有典型的PTPs結構域，其變化必然引起細胞內部磷酸化蛋白的變化，為研究該蛋白所調控的磷酸化蛋白的變化情況，我們在用SILAC標記的結腸癌細胞中敲低PTPLAD1，并運用免疫共沉淀的方法富集酪氨酸磷酸化蛋白，通過質譜共鑒定出有定量信息的蛋白質20個，表達差異倍數(heavy/ light)大于2或小于0.5的蛋白質共18個，其中在HCT-116細胞中上調8個，下調10個(圖3)，相應這些差異蛋白鑒定到的差異磷酸化位點見表3。利用IPA軟件對這些差異蛋白質進行分析，得出2條分值較高的相關細胞網絡通路，主要與器官發育分化、維持組織分化類型及與細胞凋亡增殖相關(圖4)。進一步對這些蛋白質作功能聚類分析，與腫瘤疾病相關的蛋白質18個，與細胞生存及死亡相關的蛋白質8個，與細胞形態、細胞組裝及信號轉導相關的蛋白質各6個，與胚胎發育及組織分化相關蛋白各5個。從對差異蛋白質的功能分類結果表明，PTPLAD1在結腸癌細胞調控的磷酸化蛋白主要影響細胞形態、組裝及組織分化與發育等方面。其中鑒定到許多轉錄因子及腫瘤標志物相關蛋白，如E2F8和CA125，分別在HCT-116細胞中上調0.2倍和17.7倍，見表4。

Figure 3.SILAC-IP quantitative proteomics to identify PTPLAD1-regulated phosphorylated proteins in colon cancer cell line HCT-116.A:theworkflow of the SILAC-based quantitative proteomics coupled with immunoprecipitation;B:differential ratio of the phosphorylated proteins regulated by PTPLAD1.圖3　SILAC定量蛋白質組學結合酪氨酸免疫共沉淀技術鑒定PTPLAD1在結腸癌細胞HCT-116中所調控的磷酸化蛋白

討論

有研究證實，結腸癌的發生是一個多原因參與、多階段發展、多步驟積累、多基因改變的疾病，涉及到多種癌基因的擴增和高表達，以及抑癌基因的失活等［1］。我們對PTPLAD1的蛋白序列及結構進行同源比對發現，PTPLAD1含有與酪氨酸磷酸酶PTP標志性催化活性位點非常類似的氨基酸序列(H/V) C(X)5R(S/T)。多項研究表明PTPs在細胞信號轉導過程中發揮著重要的作用，一些人類疾病如某些癌癥、糖尿病、白血病、免疫缺陷病、諾南氏綜合癥等正是由PTPs的基因突變或異常表達造成的［8］。盡管PTPLAD1蛋白含有類似PTPs，對于它是否在腫瘤細胞信號轉導過程中發揮功能未見報道。

PTPLAD1(HACD3)是用丁酸鈉處理成纖維細胞時被鑒定到的，丁酸鈉通常被用來抑制細胞的增殖并誘導其分化。研究人員稱PTPLAD1與激活的Rac1形成復合物，可能參與組成Rac1信號通路并對基因的表達起調控作用［5］。有研究報道，該家族另一蛋白成員PTPLAD2在人食管鱗狀細胞癌中的表達低于其在正常食管鱗狀上皮中的表達。PTPLAD2在癌組織浸潤廣泛、腫瘤細胞分化較低及伴有淋巴結癌轉移的病例中表達較低，PTPLAD2可能是食管癌發生及進展中的抑癌基因［9-10］。PTPLAD1與PTPLAD2同屬于HACD家族成員，具有重要的序列相似性，這提示PTPLAD1可能與腫瘤的發生有一定的相關性。

本研究通過免疫共沉淀結合SILAC定量蛋白質組學技術，分析了PTPLAD1對結腸癌細胞HCT-116蛋白磷酸化水平的影響。在敲低PTPLAD1的情況下，用抗酪氨酸磷酸化的抗體成功富集了酪氨酸磷酸化的蛋白質并結合LTQ-Orbitrap XL質譜鑒定了PTPLAD1差異表達所調控的酪氨酸磷酸化蛋白及這些蛋白磷酸化位點，進一步利用IPA軟件對這些差異酪氨酸磷酸化蛋白進行生物信息學分析［11］。

表3　PTPLAD1所調控蛋白的磷酸化位點Table 3.The phosphorylation sites of PTPLAD1-regulated proteins

Figure 4.The functional signaling networks associated with PTPLAD1 by IPA analysis.A:PTPLAD1-related functional signaling network 1 mainly involved in organmorphology，skeletal and muscular system development and function，and cellular compromise;B:network 2 mainly involved in cell death and survival，gene expression，and cellular growth and proliferation.圖4　IPA軟件分析PTPLAD1及其調控的磷酸化相關蛋白

從分析結果中，我們發現與腫瘤疾病相關的蛋白質18個，與細胞生存及死亡相關的蛋白質8個，與細胞形態、細胞組裝及信號轉導相關的蛋白質各6個。從對差異蛋白質的功能分類結果表明，PTPLAD1對結腸癌細胞磷酸化的調控，主要體現在影響細胞形態、組裝及組織分化與發育等方面。其中有許多轉錄因子及腫瘤標志物相關蛋白，如E2F8和CA125，也受到了PTPLAD1差異表達的影響。

本研究運用RNAi技術結合高通量磷酸化蛋白質組學技術，對PTPLAD1調控的差異酪氨酸磷酸化蛋白做出了初步探索。在對PTPLAD1所調控的差異酪氨酸磷酸化蛋白進行的功能蛋白組學分析中，我們鑒定出了多個在結腸癌細胞中酪氨酸磷酸化異常增高和降低的蛋白。生物信息學分析表明PTPLAD1調控的差異酪氨酸磷酸化蛋白主要是與癌癥、血液系統疾病及免疫性疾病相關，并參與器官發育分化、維持組織分化類型及細胞凋亡增殖相關通路。這些結果為進一步研究PTPLAD1在結腸癌發生發展中的分子機理提供了線索。

表4　PTPLAD1涉及到的主要疾病及生物學功能Table 4.Diseases and biofunctions involved by PTPLAD1

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Phosphoproteom ics to analyze PTPLAD1-regulated tyrosine-phosphorylated proteins in colon cancer cells

HU Yang，YANG Jie，YU Ru-yuan，WANG Yang
(Key Laboratory of Functional Protein Research ofGuangdong Higher Education Institutes，Collegeof Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:wangyang8857@gmail.com)

R329.2+1;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.014

1000-4718(2015)05-0845-07

2014-12-31［修回日期］2015-03-02

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(No.2011CB910700)

Tel:020-85227039;E-mail:wangyang8857@gmail.com