STAT1對人非小細胞肺癌H1299細胞增殖及IFN-β敏感性的影響*

趙嘉璐，孫筱茹，季東翔，陳俊杰，王夢怡，蔣磊，李玉蘋，陳成水△(溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江溫州5000;寧波市第二醫院重癥醫學科，浙江寧波5000;溫州醫科大學附屬第一醫院內科實驗室，浙江溫州5000)

STAT1對人非小細胞肺癌H1299細胞增殖及IFN-β敏感性的影響*

趙嘉璐1，孫筱茹1，季東翔1，陳俊杰1，王夢怡2，蔣磊3，李玉蘋1，陳成水1△
(1溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江溫州325000;2寧波市第二醫院重癥醫學科，浙江寧波315000;3溫州醫科大學附屬第一醫院內科實驗室，浙江溫州325000)

目的:探討信號轉導及轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)對人非小細胞肺癌H1299細胞增殖及人重組干擾素β(interferon-β，IFN-β)敏感性的影響。方法:構建STAT1基因慢病毒過表達載體Lenti-STAT1，轉染H1299細胞，建立穩定表達STAT1的細胞株，EGFP轉染組作為對照，觀察各組細胞生長情況。用不同濃度的IFN-β處理各組細胞，觀察對細胞的生長抑制作用。Western blot法檢測各組細胞內p-STAT1、ICAM-1和PCNA的蛋白水平。結果:成功構建穩定過表達STAT1及對照EGFP的H1299細胞株。過表達STAT1的H1299細胞的增殖活性明顯低于EGFP對照組(P＜0.05)，其對IFN-β的敏感性顯著高于EGFP對照組(P＜0.05)。過表達STAT1上調活化的STAT1磷酸化水平，下調ICAM-1表達。并且，STAT1增強IFN-β誘導的STAT1磷酸化水平，下調PCNA表達。結論:過表達STAT1可抑制H1299細胞增殖，增強細胞對IFN-β的敏感性，為STAT1基因聯合IFN-β治療非小細胞肺癌提供了實驗基礎。

信號轉導及轉錄激活因子1;H1299細胞;干擾素β;肺癌

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effect of signal transducer and activator of transcription 1(STAT 1)on proliferation and interferon-β(IFN-β)sensitivity of human non-small-cell lung cancer H1299 cells.METHODS:STAT1 or EGFP gene was transfected into H1299 cells by the lentiviral vectors system.The cell number was counted under amicroscope and cell proliferation was tested by MTT assay.In addition，the cells transfected with STAT1 and EGFP were treated with IFN-βand cell viability wasmeasured by MTT assay.The protein levels of p-STAT1，ICAM-1 and PCNA were detected by Western blot.RESULTS:Over-expression of STAT1 inhibited H1299 cell proliferation(P＜0.05).H1299 cells transfected with STAT1 gene had a higher sensitivity to IFN-βthan the control cells transfected with EGFP(P＜0.05).Overexpression of STAT1 increased the protein levelof p-STAT1，and reduced IACM-1 expression in H1299 cells.Moreover，STAT1 enhanced STAT1 phosphorylation and downregulated the expression of PCNA in H1299 cells treated with IFN-β.CONCLUSION:STAT1 inhibits the proliferation and enhances the IFN-βsensitivity of non-small-cell lung cancer H1299 cells.

［KEY WORDS］Signal transducer and activator of transcription 1;H1299 cells;Interferon-β;Lung neoplasms

肺癌是常見的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康，我國肺癌的發病率和死亡率逐年上升，已經成為第一位的癌癥死因［1］。目前雖然化學藥物、外科手術及放射治療方法有了很大的改進，但患者5年的生存率仍然低于15%［2］，所以尋找治療肺癌的新方法有著重要意義。

信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)最重要的功能是參與機體免疫應答和調控細胞增殖與轉化［3-4］。STAT1是STAT家族中第一個被發現的成員，Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和Ⅱ型干擾素(IFN-γ)可通過JAK-STAT通路激活STAT1參與細胞生長調節、抗病毒和免疫防御［5-6］。Meraz等［7］和Durbin等［8］發現STAT1基因剔除的小鼠對任何一種干擾素(interferon，IFN)刺激均無反應，說明STAT1參與了IFN誘導的信號轉導過程。目前，STAT1在肺癌中的作用及機制尚不清楚。本研究中，我們將STAT1基因轉染人非小細胞肺癌H1299細胞觀察其對細胞增殖的影響，及其是否增強IFN-β抗腫瘤作用，并探討可能的機制，為肺癌的治療提供實驗依據。

材料和方法

1細胞培養

人胚腎239T細胞和非小細胞肺癌H1299細胞購買于上海中科院細胞庫。293T細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養基，H1299細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

2材料

慢病毒載體Lenti-STAT1和Lenti-EGFP已于前期構建［9］。人重組IFN-β(R＆D);BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白質Marker、膜封閉液和ECL發光液(Thermo);鼠抗人ICAM-1單抗和鼠抗人STAT1單抗(BD);兔抗人p-STAT1單抗(CST);鼠抗人PCNA單抗(Abcam);MTT、鼠抗人β-actin單抗、HRP標記的山羊抗鼠II抗和山羊抗兔II抗(聯科生物公司)。

3方法

3.1慢病毒載體包裝和轉染細胞將攜帶STAT1基因的慢病毒載體Lenti-STAT1或攜帶EGFP基因的對照載體Lenti-EGFP與包裝質粒PMK-VSVG、PMDL-G/P-RRE、PRSV-REV用CaCl2轉染法共轉染293T細胞。第2天更換細胞培養基。繼續培養48 h后，收集293T細胞上清液，超速離心，棄上清，用TBS液重懸病毒沉淀。常規培養的H1299細胞接種于24孔板中，慢病毒感染細胞，同時加入聚凝胺以增加感染效率，48 h后顯微鏡觀察綠色熒光強度。

3.2細胞計數檢測細胞增殖能力使用24孔平底的細胞培養板，各孔接種細胞1.5×104個。分別在1 d、2 d和3 d經胰酶消化后置于顯微鏡下計數。

3.3MTT法檢測細胞增殖活性使用96孔平底的細胞培養板，各孔接種細胞3 000個。分別在1 d、2 d和3 d時加20μLMTT溶液，4 h后終止培養，棄上清，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀下選擇波長450 nm測定各孔吸光度。根據各組細胞的吸光度值繪制出細胞生長曲線。將各組細胞以每孔1 000個接種于96孔細胞培養板，無血清培養液饑餓培養24 h后行藥物干預。用不同濃度的IFN-β(濃度分為1×104、1× 105和1×106U/L)處理各組細胞，72 h后處理組和未處理組分別采用MTT法檢測各組的吸光度值，計算各組細胞的生長抑制率。

3.4Western blot實驗收集各組細胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每組取40μg蛋白樣品經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h后，I抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，加II抗室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，ECL化學發光顯色，X光顯影。

4統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據以均值±標準差(mean±SD)表示。多組間均數的比較均采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1細胞綠色熒光蛋白和STAT1蛋白的檢測

慢病毒轉染H1299細胞48 h后，熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光蛋白表達，Western blot實驗結果顯示轉染STAT1組H1299細胞STAT1蛋白過表達，見圖1。

2STAT1過表達對人非小細胞肺癌H1299細胞增殖及IFN-β敏感性的影響

穩定轉染后的H1299細胞經顯微鏡下計數后結果顯示，Lenti-STAT1組細胞的數量明顯低于Lenti-EGFP對照組(P＜0.05)。經MTT法檢測繪制生長曲線顯示，Lenti-STAT1組細胞的增殖活性明顯低于lenti-EGFP對照組(P＜0.05)。各組H1299細胞用不同濃度的IFN-β處理72h，MTT法檢測計算細胞生長抑制率。Lenti-STAT1組細胞在各濃度IFN-β處理后，其細胞的生長抑制率顯著高于Lenti-EGFP對照組(P＜0.05)，見圖2。

3STAT1過表達對H1299細胞p-STAT1、ICAM-1和PCNA蛋白表達的影響

Western blot實驗結果發現，同EGFP組細胞相比，lenti-STAT1組細胞的p-STAT1(Tyr701)蛋白水平明顯升高，而ICAM-1蛋白水平明顯低于對照組。在1×106U/L IFN-β干預72 h后，與EGFP組細胞相比，Lenti-STAT1組細胞的p-STAT1蛋白水平明顯升高，PCNA的蛋白量明顯低于對照組，見圖3。

Figure 1.The expression of green fluorescent protein in H1299 cells transfected with Lenti-STAT1 by immunofluorescence(A，×100)and the protein expression of STAT1 in H1299 cells transfected with Lenti-STAT1 determined by Western blot(B).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.圖1　慢病毒Lenti-STAT1轉染效果及轉染后STAT1蛋白的表達情況

Figure 2.Effects of STAT1 overexpression on the proliferation and IFN-βsensitivity of H1299 cells.A:overexpression of STAT1 inhibited H1299 cell growth;B:overexpression of STAT1 inhibited the proliferation of H1299 cells detected by MTT assay; C:effect of STAT1 overexpression on the sensitivity of H1299 cells to IFN-βfor 72 h.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.圖2　STAT1過表達對H1299細胞增殖及IFN-β敏感性的影響

討論

JAK-STAT信號轉導途徑是細胞因子信號轉導中最常見、最直接的途徑，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等重要的生物學過程［3］。STAT1是STAT家族第一個發現的成員，通常被認為是一種腫瘤抑制蛋白［10］，研究結果顯示STAT1在乳腺癌、黑素瘤中及白血病扮演抑癌基因的角色［11-13］。STAT1的抑癌作用主要是通過上調caspases 2，3和7［14］、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A［15］和IRF1/p53通路的表達［16］。雖然STAT1作為抑癌基因被逐漸認識，但其在肺癌中的作用尚不明確。

我們課題組前期通過Western blot檢測了40例肺癌組織及鄰近肺正常組織中STAT1蛋白的表達，結果顯示晚期肺癌組織STAT1表達顯著低于早期肺癌組織［17］，提示STAT1可能在肺癌發生、發展中扮演重要角色。本研究中，我們利用慢病毒表達載體攜帶STAT1基因［9］轉染非小細胞肺癌H1299細胞，觀察STAT1對H1299細胞增殖的影響。結果發現，STAT1過表達組的細胞增殖活性明顯低于對照細胞，STAT1在肺癌中可能作為抑癌基因抑制肺癌細胞的生長。

Figure 3.Effects of STAT1 overexpression on the protein levels of p-STAT1，ICAM-1 and PCNA in H1299 cells.A:overexpression of STAT1 increased the protein level of p-STAT1，reduced the expression of IACM-1;B，C:STAT1 enhanced STAT1 phosphorylation and downregulated the expression of PCNA in H1299 cells treated with IFN-βfor 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.圖3　STAT1過表達對H1299細胞p-STAT1、ICAM-1和PCNA蛋白表達的影響

同時，我們發現STAT1可以增強IFN-β對肺癌細胞生長的抑制作用。IFN/STAT1信號轉導通路是介導宿主微環境成分和腫瘤細胞之間的代表性通路，調節腫瘤細胞的生長［18-19］，而IFN誘導的信號轉導和腫瘤免疫監視則需要STAT1的參與［20］。IFN-β用于血液系統惡性腫瘤等多種腫瘤的治療并取得了一定的成功［21］，但IFN-β半衰期短，需要提高用藥劑量才會對腫瘤產生毒性作用［22］。而一些腫瘤患者對干擾素治療缺乏反應或者耐藥，可能與腫瘤細胞STAT1缺失相關。我們的研究結果也提示過表達STAT1能增加腫瘤細胞對干擾素的敏感性，為干擾素聯合STAT1基因治療肺癌提供了實驗依據。

ICAM-1與腫瘤的復發、轉移密切相關。ICAM-1的表達隨著腫瘤惡性程度的增高而增強，與腫瘤的分級及預后有關，可作為判定腫瘤侵襲的指標之一［23］。課題組前期研究顯示STAT1在肺癌早期中的表達明顯高于晚期［17］，而ICAM-1則恰恰相反，這提示我們肺癌組織中STAT1和ICAM-1的表達可能存在負相關。進一步研究發現，STAT1可通過活化STAT1的磷酸化，下調ICAM-1的表達進而抑制肺癌細胞的生長。PCNA即增殖細胞核抗原，參與細胞周期的調節，是反映細胞增殖活性的標志物，與腫瘤細胞的侵襲、轉移及預后相關［24］。范賢明等［25］用免疫組化方法檢測發現非小細胞肺癌組織中的STAT1與PCNA呈明顯負相關。在本研究中，我們用IFN-β干預細胞，發現STAT1能增強IFN-β誘導的STAT1磷酸化水平，下調PCNA的表達，提高了IFN-β對肺癌細胞的生長抑制作用。

基因治療是疾病治療的有效途徑，而慢病毒載體的研究已成為基因治療的研究熱點，本實驗通過慢病毒表達載體在人非小細胞肺癌H1299細胞中過表達STAT1基因，發現STAT1通過促進STAT1磷酸化水平，抑制ICAM-1表達，抑制腫瘤細胞增殖。同時過表達STAT1增加細胞對IFN-β的敏感性，其分子機制可能主要通過增強IFN-β誘導的STAT1磷酸化水平。綜上所述，我們的研究為STAT1基因聯合IFN-β治療肺癌提供了實驗依據，并可能為未來肺癌的治療提供新的思路。

［1］陳萬青，張思維，鄒小農.中國肺癌發病死亡的估計和流行趨勢研究［J］.中國肺癌雜志，2010，13(5):488-493.

［2］陳首英，劉福林，龐志剛，等.肺癌病人5年生存率及生存因素分析［J］.預防醫學文獻信息，2004，10(1): 1-3.

［3］Yu H，Pardoll D，Jove R.STATs in cancer inflammation and immunity:a leading role for STAT3［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(11):798-809.

［4］Catlett-Falcone R，Dalton WS，Jove R.STAT proteins as novel targets for cancer therapy.Signal transducer an activator of transcription［J］.Curr Opinion Oncol，1999，11 (6):490-496.

［5］Schreiber RD，Old LJ，Smyth MJ.Cancer immunoediting:integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion［J］.Science，2011，311(6024):1565-1570.

［6］Sakamoto E，Hato F，Kato T，etal.Type Iand type IIinterferons delay human neutrophil apoptosis via activation of STAT3 and up-regulation of cellular inhibitor of apoptosis［J］.JLeukoc Biol，2005，78(1):301-309.

［7］Meraz MA，White JM，Sheehan KC，et al.Targeted disruption of the Stat1 gene in mice reveals unexpected physiologic specificity in the JAK-STAT signaling pathway［J］.Cell，1996，84(3):431-442.

［8］Durbin JE，Fernandez-Sesma A，Lee CK，et al.Type I IFNmodulates innate and specific antiviral immunity［J］.Immunol，2000，164(8):4220-4228.

［9］陳俊杰，胡建軍，陳成水，等.改建型STAT1-CC基因慢病毒表達載體的構建及其在肺癌A549細胞中的表達［J］.溫州醫學院學報，2012，42(3):209-213.

［10］Kim HS，Lee MS.STAT1 as a keymodulator of cell death［J］.Cell Signal，2007，19(3):454-465.

［11］Klover PJ，Muller WJ，Robinson GW，et al.Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden［J］.Neoplasia，2010，12(11):899-905.

［12］Kovarik J，Boudny V，Kocak I，et al.Malignantmelanoma associateswith deficient IFN-induced STAT 1 phosphorylation［J］.Int JMol Med，2003，12(3):335-340.

［13］Bowman T，Garcia R，Turkson J，et al.STATs in oncogenesis［J］.Oncogene，2000，19(21):2474-2488.

［14］Sironi JJ，Ouchi T.STAT1-induced apoptosis ismediated by caspases 2，3，and 7［J］.J Biol Chem，2004，279 (6):4066-4074.

［15］Chin YE，Kitagawa M，Su WC，et al.Cell growth arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF1/CIP1mediated by STAT1［J］.Science，1996，272 (5262):719-722.

［16］Townsend PA，Scarabelli TM，Davidson SM，etal.STAT-1 interacts with p53 to enhance DNA damage-induced apoptosis［J］.JBiol Chem，2004，279(7):5811-5820.

［17］張潔，陳俊杰，陳成水，等.STAT1和ICAM-1在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義［J］.中國病理生理雜志，2012，28(8):1378-1382.

［18］Levy DE，Darnell JE Jr.Stats:transcriptional control and biological impact［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3 (9):651-662.

［19］Samuel CE.Antiviral actions of interferons［J］.Clin Microbiol Rev，2001，14(4):778-809.

［20］Yao YX，Kubota1 T，Sato K，et al.Interferons upregulate thymidine phosphorylase expression via JAK-STAT-dependent transcriptional activation and mRNA stabilization in human glioblastoma cells［J］.JNeurooncol，2005，72 (3):217-223.

［21］Trinchieri G.Type I interferon:friend or foe?［J］.JExp Med，2010，207(10):2053-2063.

［22］Qin XQ，Tao N，Dergay A，et al.Interferon-beta gene therapy inhibits tumor formation and causes regression of established tumors in immune-deficient mice［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，1998，95(24):14411-14416.

［23］BenekliM，Gullu IH，Tekuzman G，et al.Circulating intercellular adhesion molecule-1 and E-selectin levels in gastric cancer［J］.Br JCancer，1998，78(2):267-271.

［24］Dieredonck JH，Wijsman JH，Keijzer R，et al.Cell-cycle-related staining patterns of anti-proliferating cell nuclear antigenmonoclonal antibodies.Comparison with BrdUrd labeling and Ki-67 staining［J］.Am J Phathol，1999，138(5):1165-1172.

［25］范賢明，張玲，張世波.STAT1和PCNA在肺癌組織中的表達及其臨床意義［J］.瀘州醫學院學報，2005，28(1):7-9.

Influence of STAT1 on proliferation and IFN-βsensitivity of human nonsmall-cell lung cancer H1299 cells

ZHAO Jia-lu1，SUN Xiao-ru1，JIDong-xiang1，CHEN Jun-jie1，WANG Meng-yi2，JIANG Lei3，LIYu-ping1，CHEN cheng-shui1
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;2Department of Intensive Care Unit，Ningbo No.2 Hospital，Ningbo 315000，China;3Laboratory of Internal Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325000，China.E-mail: chenchengshui@126.com)

R734.2;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.015

1000-4718(2015)05-0852-05

2015-01-05［修回日期］2015-02-12

國家自然科學基金資助項目(No.81400035);溫州市科技計劃項目(No.20140052)

Tel:0577-55578186;E-mail:chenchengshui@126.com