大鼠原代肝星狀細胞活化后組蛋白修飾水平的觀察*

田甜，張金娟，羅新華，謝汝佳，韓冰，楊婷，陳騰祥，楊勤(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州貴陽550000)

大鼠原代肝星狀細胞活化后組蛋白修飾水平的觀察*

田甜，張金娟，羅新華，謝汝佳，韓冰，楊婷，陳騰祥，楊勤△
(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州貴陽550000)

目的:觀察體外培養大鼠肝星狀細胞(HSCs)活化過程中組蛋白修飾的改變以及與HSCs活化指標α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的關系，探討組蛋白修飾在HSCs活化過程中可能的作用。方法:體外分離、鑒定、培養大鼠HSCs，光鏡觀察HSCs活化過程中的形態變化，細胞免疫熒光染色和Western blotting檢測desmin和α-SMA的表達，比較靜止型HSCs和激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化、H3K4二甲基化和H3K9二甲基化的變化。結果:(1)細胞形態學觀察結果表明HSCs在培養過程中形態由靜息狀態向高度分化的肌成纖維細胞轉化。細胞免疫熒光染色及Western blotting檢測結果顯示，分離培養24 h的HSCs有desmin表達，但幾乎不表達α-SMA;隨著培養時間延長，HSCs內α-SMA和desmin表達逐步增加，至15 d時達到最大。(2)根據HSCs細胞形態變化及HSCs活化標志蛋白檢測結果，確定培養24 h的HSCs為靜止型HSCs，培養15 d的HSCs為激活型HSCs，分別檢測其組蛋白修飾變化。結果顯示，與靜止型HSCs比較，激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化和H3K9二甲基化修飾水平明顯降低(P＜0.01)，而H3K4二甲基化修飾水平明顯增加(P＜0.01)，且H3K4二甲基化修飾水平變化與α-SMA表達變化一致。結論:在體外培養HSCs活化過程中，組蛋白修飾發生明顯異常，提示組蛋白修飾改變有可能參與了HSCs活化以及肝纖維化的發生。

肝星狀細胞;組蛋白修飾;肝纖維化

［KEY WORDS］Hepatic stellate cells;Histonemodifications;Liver fibrosis

近年來研究表明，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是肝纖維化形成的中心環節，HSCs自分泌的多種細胞因子作用于HSCs表面的受體，通過細胞內信號轉導，不斷刺激HSCs自身分裂增殖，并大量合成和分泌膠原等細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)在肝內沉積，最終導致肝纖維化［1］。表觀遺傳是不通過DNA序列改變就能影響基因表達的、可遺傳的調控方式，包括DNA甲基化、微小RNA(microRNA，miRNA)和組蛋白修飾等。近來有研究提示，表觀遺傳機制在肝星狀細胞激活過程中可能起重要調控作用。Chen等［2］研究發現，大鼠HSCs由靜止狀態轉為活化狀態后miR-335和miR-150表達發生顯著下調，而miR-143、miR-145和miR-121卻明顯上調，認為這些在肝纖維化進程中差異表達的miRNA可靶向調控HSCs活化增殖相關的細胞因子或蛋白，調控HSCs的活化增殖，進而參與肝纖維化發生發展。Bian等［3］的研究發現PTEN基因高甲基化可激活PI3K/AKT與ERK通路來參與HSCs的活化及肝纖維化的形成。然而，組蛋白修飾作為表觀遺傳的一個重要內容，其是否參與HSCs活化及ECM產生的調控，目前仍不清楚。組蛋白修飾主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，其中以組蛋白的乙酰化和甲基化研究最多。這些修飾可作為一種標記或語言組成“組蛋白密碼”，被一系列特定的蛋白質所識別，并將其轉譯成一種特定的染色質狀態以實現對特定基因的調節。本實驗擬分離培養大鼠原代HSCs，觀察HSCs在活化前后組蛋白修飾4個位點水平變化，了解在HSCs激活過程中組蛋白修飾的變化以及與HSCs產生的ECM的相關性，以探討組蛋白修飾在HSCs活化中可能的作用及與肝纖維化發生的關系。

材料和方法

1實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠，體重400～500 g，由貴州省實驗動物中心提供，合格證編號為(黔)2003-001。

2主要試劑

DNaseⅠ購自Solarbio;IV型膠原酶購自Sigma; Opetiprep密度梯度離心液購自Axis-Shield;DMEM培養基購自HyClone;胎牛血清購自Gibco;強細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、兔抗H3K9me2、兔抗H3K4me2、Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG(H+L)以及DyLight 549標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術有限公司;鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單抗購自Santa Cruz;兔抗desmin、兔抗acH4K12、兔抗acH3K9和兔抗GAPDH抗體購自Bioworld。

3主要方法

3.1原代HSCs的分離和培養大鼠HSCs的分離參考戴春蕾等［4］的方法。細胞分離后，用臺盼藍染色鑒定細胞活率。以含20%胎牛血清及雙抗的DMEM培養液調整細胞濃度為1×1010/L，接種于6 cm無包被塑料培養皿和激光共聚焦皿中，置于5% CO2、37℃CO2培養箱中培養。接種24 h后首次換液，以后每2～3 d換1次液。并于倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

通過上述方法分析得出，3階模態的振型圖是獨立的，表5顯示與其他模態置信度相比很低，所以其為真實模態。1階模態與2階模態的頻率接近，二者振型圖為對稱2點間的上下振動。4階與5階模態的頻率接近，振型圖均為邊緣彎曲振動。6階模態與7階模態的頻率接近，振型圖為內部的扭轉振動。對比MAC值，發現第1階模態與第2階模態的置信度很高，確認二者為重根模態。分析4階與5階模態為密集模態或重根模態，進行二級驗證。

3.2細胞免疫熒光法觀察HSCs中desmin和α-SMA的表達吸棄激光共聚焦皿內培養液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，3%BSA封閉1 h，滴加1∶50稀釋的兔抗desmin抗體(或1∶50稀釋鼠抗α-SMA)，4℃孵育過夜，加入1∶200稀釋的Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)［或1∶100稀釋的DyLight549標記山羊抗兔IgG(H+L)］，室溫孵育2 h，PBS洗滌后DAPI染核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.3Western blotting檢測HSCs中α-SMA、desmin、acH4K12、acH3K9、H3K9me2以及H3K4me2的修飾水平吸棄培養液，預冷PBS洗滌后以細胞裂解液冰上裂解細胞，高速離心后收集上清，BCA試劑盒檢測細胞總蛋白。蛋白定量后進行加樣，上樣量為40μg，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電轉移至硝酸纖維素膜，含5%脫脂奶粉的TBST封閉，分別加入1∶1 000稀釋的鼠抗α-SMA抗體、1∶1 000稀釋兔抗desmin抗體、1∶500稀釋兔抗acH4K12抗體、1∶500稀釋兔抗acH3K9抗體、1∶1 000稀釋兔抗H3K9me2抗體、1∶1 000稀釋H3K4me2抗體和1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，4℃過夜。次日TBST洗膜，辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯示特異條帶。GAPDH抗體作為內參照。利用GeneTools圖像分析軟件對每個條帶灰度進行定量分析。

4統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 17.0統計軟件包處理。兩組樣本均數比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1分離HSCs的得率、存活率及純度

光鏡下計數分離得到的HSCs，臺盼藍染色判斷細胞存活率。結果顯示，每只大鼠肝臟分離純化后HSCs的細胞得率約為4.0×107，細胞存活率為95%。以desmin免疫熒光染色顯示原代HSCs結果表明陽性率為96%，見圖1。

Figure 1.Desmin expression in HSCs at24 h observed by immunofluorescence(×200).圖1　細胞免疫熒光檢測desm in在培養24 h的HSCs中的表達

2體外培養過程中大鼠原代HSCs的形態變化

鏡下觀察剛分離的HSCs呈折光性很強的圓球形，培養24 h后細胞基本貼壁，胞質內含大量折光性強的顆粒。隨培養時間增加，細胞逐漸伸展，培養3 d時細胞體較大，胞質內含較多折光性強顆粒，開始伸出偽足。第5～10天細胞內折光性強的顆粒逐漸減少，細胞繼續伸展，開始融合成片。第15天時，細胞內折光性強顆粒明顯減少，絕大多數細胞呈典型星形，梭形，融合成片，見圖2。

Figure 2.Themorphological changes of HSCs isolated from rats during the culture(×200).圖2　不同培養時間大鼠肝星狀細胞形態學觀察

3體外培養HSCs過程中α-SMA和desm in免疫熒光染色

分別用黃色熒光和綠色熒光標記desmin和α-SMA蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見:分離培養24 h的HSCs中有desmin陽性表達，而幾乎沒有α-SMA陽性表達;分離培養3 d后的HSCs desmin陽性表達逐漸增多(＞90%)，并可見較多α-SMA陽性表達(＞85%);隨著培養時間延長，HSCs中desmin及α-SMA陽性明顯增多，至培養15 d時幾乎所有的HSCs中都有desmin和α-SMA陽性表達(＞98%)，且在細胞中可見細胞骨架呈典型的肌絲狀條紋，見圖3、4。

Figure 3.The expression ofα-SMA in the HSCs cultured at different time points observed by immunofluorescence(×200).圖3　α-SMA在不同培養時間的HSCs中的免疫熒光觀察

4Western blotting檢測HSCs培養過程中α-SMA和desm in蛋白的表達

Western blotting結果顯示，在HSCs分離培養的不同時期都有desmin蛋白表達，且desmin蛋白表達量隨著培養時間延長而增加。分離培養24 h的HSCs基本不表達α-SMA，培養3 d后的HSCs開始表達α-SMA，且α-SMA的表達隨培養時間增加逐漸增加，至15 d時α-SMA的表達量達到最大，見圖5。

Figure 4.The expression of desmin in the HSCs cultured at different time points observed by immunofluorescence(×200).圖4　Desm in在不同培養時間的HSCs中的免疫熒光

Figure 5.The expression ofα-SMA and desmin in the HSCs cultured at different time points detected by Western blotting.Mean± SD.n=5.*P＜0.05 vs24 h.圖5　α-SMA和desm in在不同培養時間的HSCs中的表達

5Western blotting檢測培養24 h HSCs和培養15 d的HSCs中組蛋白acH4K12、acH3K9、H3K9me2和H3K 4m e2修飾水平

根據培養細胞內desmin及α-SMA蛋白表達情況分別將培養24 h、3 d和15 d HSCs視為靜止HSCs、部分活化HSCs和完全活化HSCs。我們選取培養24 h HSCs(靜止HSCs)和培養15 d HSCs(激活HSCs)作為研究對象，用Western blotting檢測其組蛋白修飾情況。結果顯示，培養15 d HSCs中H4K12和H3K9乙酰化修飾水平明顯較培養24 h HSCs降低(P＜0.01)。進一步檢測HSCs細胞中組蛋白甲基化水平的結果顯示，與培養24 h HSCs相比，培養15 d的HSCs中H3K4二甲基化水平明顯增高，組蛋白H3K9甲基化水平明顯減低(P＜0.01)，見圖6。

Figure 6.The expression of acH4K12，acH3K9，H3K9me2 and H3K4me2 in 24 h HSCs and 15 d HSCs isolated from the rats.Mean ±SD.n=5.*P＜0.01 vs24 h HSCs.圖6　靜止型和激活型HSCs中acH4K12、acH3K 9、H3K 9me2和H3K4me2的修飾水平

討論

肝星狀細胞位于肝竇內皮與肝細胞之間的Disse間隙內，呈典型的樹突狀突起星芒狀結構，以表達desmin等間質標記為特征［5］。在生理狀態下，HSCs呈靜止狀態，其主要功能是儲存和代謝維生素A，合成和分泌少量ECM，但不表達α-SMA。當各種因素造成肝細胞損傷時，在肝細胞和其它非實質細胞分泌的細胞因子作用下，HSCs形態由星狀變成梭形，脂滴消失，變成肌成纖維樣細胞，表達α-SMA，轉變成為激活型HSCs，后者產生大量ECM在肝臟內沉積，形成肝纖維化。有研究發現，在無包被的塑料培養皿上培養靜止型HSCs，隨著培養時間延長，靜止型HSCs可發生自發活化，其形態變化及標志物表達的改變與體內肝纖維化發生過程中HSCs變化相似［6］。靜止型的HSCs不表達α-SMA，故α-SMA被認為是HSCs活化的標志，其表達量的大小可用來衡量HSCs激活程度，也可以反映活化HSCs分泌ECM量［7］。

本實驗采用體外膠原酶循環灌注結合密度梯度離心法分離得到原代HSCs后，在鏡下觀察到剛分離的HSCs呈圓球形，培養24 h后細胞基本貼壁，胞質內含大量折光性強的顆粒;隨培養時間增加，細胞逐漸伸展，培養3 d時開始伸出偽足，培養5～10 d時細胞繼續伸展，胞內折光性強的顆粒逐漸減少，培養第15天時，絕大多數細胞呈典型星形，梭形，融合成片。這與文獻報道中HSCs形態變化相符。我們通過細胞免疫熒光染色和Western blotting分別對不同培養時間的HSCs細胞內desmin和α-SMA表達進行檢測，以期對分離得到的細胞進行鑒定，結果顯示，分離培養24 h的HSCs細胞表達desmin但不表達α-SMA，分離培養3 d的HSCs細胞持續表達desmin并開始表達一定量的α-SMA，而培養15 d的HSCs細胞顯示高表達desmin和α-SMA，且在細胞內可見細胞骨架呈明顯肌絲樣條紋，其形態學變化及細胞活化標志物變化與既往文獻報道一致，由此我們初步認定分離培養24 h HSCs細胞為靜止型HSCs，分離培養3 d的HSCs為部分活化型HSCs，而培養15 d的HSCs為完全激活型HSCs。鑒于本文主要研究研究HSCs由靜止型轉變為激活型后組蛋白修飾變化，故選用培養24 h HSCs和15 d HSCs作為研究對象。

組蛋白修飾是表觀遺傳學的重要組成部分。有關肝纖維化的表觀遺傳學研究已經發現DNA甲基化和微小RNA都參與HSCs激活的調控，推測組蛋白修飾有可能也參與其中。組蛋白有多種共價修飾方式，其中H3K9乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4me2和H3K9me2是修飾基因轉錄調控的重要機制［8］。一般認為組蛋白乙酰化修飾中和其氨基端賴氨酸殘基的正電荷，削弱了組蛋白與DNA的接觸，DNA易于解聚，染色質呈轉錄活性結構，進而激活基因轉錄。組蛋白乙酰化狀態受組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶調控，取決于兩者的動態平衡［9］。有研究發現H3K4me2使組蛋白和DNA結構由緊變松，靶基因才能和轉錄復合物相互作用而得以轉錄［10］。還有研究認為H3K9me2能使組蛋白形成一個異染色質蛋白1(heterochromatin protein 1)結合位點，導致DNA分子上特定CpG島的甲基化而使基因沉默［11］。不同組蛋白修飾可依次發揮作用或組合在一起，形成一個修飾的級聯，通過協同或拮抗來共同發揮調節作用。我們對靜止型HSCs與激活型HSCs acH4K12、acH3K9、H3K9me2及H3K4me2觀察的實驗結果表明，分離培養15 d(激活型)HSCs中H4K12乙酰化水平較培養24 h(靜止型)HSCs明顯降低，這一結果與Qin等［12］發現大鼠HSCs培養活化過程中H4K12乙酰化水平逐漸減少的研究結果一致。此外Qin等［12］還發現肝纖維化大鼠MMP13基因啟動子區H4總乙酰化水平也是減少的，認為MMP13基因H4總乙酰化水平降低會抑制MMP13基因的轉錄，以致沒有足夠的MMP13蛋白來降解ECM，導致ECM在肝內沉積是最終引起肝纖維化的根本原因。我們還發現激活型HSCs中H3K9乙酰化水平也較靜止型HSCs為低，但α-SMA的表達卻較靜止型HSCs明顯增加。結合我們實驗室及其他學者以往的研究發現在肝纖維化大鼠肝臟HSCs活化增殖的同時伴有肝臟MMP-1等基質金屬蛋白酶表達增加，細胞外基質成分明顯增多的結果［13］，我們推測激活型HSCs中H4K12乙酰化水平降低有可能參與膠原代謝相關酶基因調控而參與肝纖維化的發生。有學者用去乙酰化酶抑制劑拉格唑拉處理大鼠原代激活型HSCs后，發現伴隨著組蛋白3和組蛋白4的總乙酰化水平明顯增加，而HSCs中α-SMA、Ⅰ型膠原和TIMP-1的表達明顯降低［14］，表現出抗肝纖維化效應的結果也進一步支持我們的推測。有關激活型HSCs中H4K12乙酰化水平改變如何調控膠原代謝相關酶基因的機制尚有待進一步研究。

在本研究中我們還發現激活的HSCs中H3K4me2水平增加和H3K9me2水平減少，表明在HSCs活化過程中存在組蛋白H3K4me2和H3K9me2修飾改變。有研究發現在肝硬化患者肝組織中H3K4me2的去甲基化轉移酶RBP2和α-SMA表達上調，通過沉默LX-2 HSCs中RBP2基因后發現α-SMA表達下調同時HSCs增殖抑制，過表達LX-2 HSCs中RBP2基因后發現α-SMA的表達上調，因此認為RBP2調控了肝硬化患者肝臟中α-SMA的表達，從而參與肝硬化的病理過程［15］。由此我們認為激活型HSCs中H3K4me2修飾改變與α-SMA表達上調及肝纖維化發生可能存在某種聯系。有學者發現在正常腦組織中存在H3K4me2修飾，而在星形細胞瘤中H3K4me2修飾水平增加，且隨星形細胞瘤病理分級的增高而增高［16］，提示H3K4me2修飾可能是星形細胞增殖的一個標志。因此，我們推測在激活的HSCs中發現的H3K4me2修飾水平的改變也可能是HSCs活化增殖的一個標志，可成為判斷肝纖維化進展的一個指標。

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Levels of histonemodifications in activated primarily cultured rat hepatic stellate cells

TIAN Tian，ZHANG Jin-juan，LUO Xin-hua，XIE Ru-jia，HAN Bing，YANG Ting，CHEN Teng-xiang，YANG Qin
(Department of Pathophysiology，Guiyang Medical University，Guiyang 550000，China.E-mail:qinyang@gmc.edu.cn)

R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.018

1000-4718(2015)05-0871-06

2014-10-24［修回日期］2015-02-05

國家自然科學基金資助項目(No.81160064);貴州省科技廳聯合基金［黔科合LG字(2012)023號］

Tel:0851-6908489;E-mail:qinyang@gmc.edu.cn