泛素蛋白酶系統通過穩定PPARγ調節脂肪細胞分化*

唐照，張葉敏，李明欣，汪長華(武漢大學基礎醫學院病理生理學教研室，湖北武漢430071)

泛素蛋白酶系統通過穩定PPARγ調節脂肪細胞分化*

唐照，張葉敏，李明欣，汪長華△
(武漢大學基礎醫學院病理生理學教研室，湖北武漢430071)

目的:探討泛素蛋白酶系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)在體外脂肪細胞分化中的作用。方法:常規方法誘導前脂肪細胞分化為脂肪細胞，Western blot檢測蛋白質表達，免疫共沉淀檢查蛋白質間結合，油紅O染色檢測脂肪細胞中的脂質，RT-PCR檢測mRNA表達。結果:UPS抑制劑硼替佐米可抑制3T3-L1前脂肪細胞分化為脂肪細胞，表現為細胞內脂質含量降低以及脂肪細胞標志蛋白mRNA表達的降低。蛋白激酶G激動劑西地那非可激活UPS，并增強脂肪細胞的分化。抑制UPS可降低熱休克蛋白90(HSP90)和過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)間的結合;同時降低細胞可溶性組分中HSP90和PPARγ的表達，增強其在不可溶性組分中的表達。HSP90特異性的N末端抑制劑格爾德霉素可抑制西地那非促進的PPARγ表達和脂肪細胞的分化。結論:泛素蛋白酶系統通過HSP90調節PPARγ的表達，從而影響脂肪細胞的分化。

泛素蛋白酶系統;過氧化物酶體增殖物活化受體γ;熱休克蛋白90;脂肪細胞;細胞分化

［ABSTRACT］AIM:To investigate the role of ubiquitin-proteasome system(UPS)in adipocyte differentiation.METHODS:Differentiation of3T3-L1 preadipocytes into adipocytes was induced by treatmentwith insulin，3-isobutyl-1-methylxanthine and dexamethasone.Western blotand immunoprecipitation were performed to detect the protein abundances and association，respectively.Oil red O staining was used to determine the intracellular lipid of 3T3-L1 adipocytes.The levels ofmRNA weremeasured by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).RESULTS:UPS inhibitor bortezomib(BZM)suppressed the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes，evidenced by reduced intracellular content of triglyceride，and decreased mRNA expression of adipogenicmarker proteins such as adiponectin and adipocyte protein 2.In contrast，administration of sildenafil(SDN)，an activator of protein kinase G which was also found to activate UPS，promoted adipocyte differentiation.In addition，BZM treatment decreased the expression of heat shock protein 90(HSP90)and peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)in the soluble fraction and reduced association of HSP90 and PPARγ.Furthermore，HSP90-specific N-terminal inhibitor geldanamic mitigated SDN-induced increase in PPARγlevel and 3T3-L1 cell differentiation.CONCLUSION:UPSmodulates HSP90-dependent PPARγstability，thus leading to promotion of adipocyte differentiation.

［KEY WORDS］Ubiquitin-proteasome system;Peroxisome proliferator-activated receptor gamma;Heat shock protein 90;Adipocytes;Cell differentiation

脂肪細胞一般分為白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞，前者的主要功能是以甘油三酯(triglyceride，TG)的形式儲存能量，而棕色脂肪的主要功能是消耗能量［1］。近年研究表明:白色脂肪細胞還具有重要的內分泌功能，可以分泌多種激素或者脂質因子(adipokines)，調節體內眾多的生理或病理活動［2］。白色脂肪細胞的結構和功能紊亂可引發肥胖、胰島素抵抗、炎癥，并與多種疾病如糖尿病、腫瘤、心腦血管疾病等的發生、發展有關［3］。脂肪細胞的分化對脂肪細胞的結構和功能變化具有重大影響［4］。因此，探討脂肪細胞分化的詳細機制、研究其調節因素，尤其是白色脂肪向棕色脂肪的轉化機制已成為具有廣闊應用前景的研究新領域［4］。

泛素蛋白酶系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)和細胞自噬是細胞內蛋白質降解的2種主要方式，參與了脂肪細胞分化的調節。研究已經證實，白色脂肪細胞的分化早期有細胞自噬的參與［5］，而脂肪細胞的衰老與UPS活性的變化和脂肪細胞的分化具有密切關系［6］。然而，UPS在調節白色脂肪細胞分化中的具體作用和詳細機制仍不清楚。本研究發現，UPS是白色脂肪細胞分化所必需的，UPS通過調節熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)與過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)結合，從而影響PPARγ的表達水平，并由此調節脂肪細胞的分化。

材料和方法

1材料與試劑

抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、PPARγ和HSP90的抗體(CST);抗tubulin抗體、堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(Santa Cruz);胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)為Sigma產品;泛素蛋白酶系統抑制劑硼替佐米(bortezomib)、HSP90特異性的N末端抑制劑格爾德霉素(geldanamycin，GA)和蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)激動劑西地那非(sildenafil，SDN)均購自Calbiochem;蛋白A瓊脂糖珠(Protein-A Agarose)為Amersham-Pharmacia Biotech產品。

2細胞培養與脂肪細胞分化

3T3-L1前脂肪細胞購自ATCC，并按要求培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM中。脂肪細胞的分化按文獻方法進行［7-8］，基本步驟如下:100%匯合的3T3-L1前脂肪細胞繼續常規培養3 d;然后，采用含1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/ L IBMX、1.67μmol/L胰島素和10%FBS的DMEM，以及含0.41μmol/L胰島素和10%FBS的DMEM先后誘導分化各3 d;其后，誘導分化的細胞培養于常規培養液中。誘導分化10 d后，90%以上的前脂肪細胞將分化為脂肪細胞，并可用于實驗。

3主要實驗方法

2.1 風險識別。要實現對風險進行有效的預防前提是要對風險進行識別，風險識別是利用有效的系統、經驗的技術手段和科學的方法對事故發生前各種風險的大小、風險存在的原因進行全面、聯系分析的過程。風險識別包括分析風險的關鍵環節、風險的事故種類和風險的控制重點等。

3.1油紅(oil red)O染色誘導分化10 d后的細胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次、4%的多聚甲醛固定20 min、PBS漂洗3次、油紅O染料染色30 min，最后用去離子水除去未結合的染料［8］。

3.2TG的測定甘油三酯定量試劑盒購自Abcam，測定方法按試劑盒說明書進行。

3.3細胞病毒感染融合泛素蛋白酶系統作用底物的綠色熒光蛋白GFPu用于反向報告活體細胞內UPS的功能活性［9］。為使培養細胞過度表達GFPu，細胞分別與攜帶GFPu的重組腺病毒Ad/GFPu和攜帶β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)對照腺病毒Ad/β-Gal(均由美國南達科他大學醫學院汪學軍教授贈送)在無血清條件下共同培養6 h(MOI=100)，然后更換為常規培養液。48 h后分組實驗。

3.4RT-PCR實驗按本實驗室已報告的方法進行［2］，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第1鏈和第2鏈。小鼠脂聯素的上游引物為5’-CCCAAGGGAACTTGTGCAGGTTGGATG-3’，下游引物為5’-GTTGGTATCATGGAAGAGAAGAAA-3’;小鼠脂肪細胞蛋白2(adipocyte protein 2，aP2)的上游引物為5’-GCGTAAATGGGGATTTGGTC-3’，下游引物為5’-CTCCTGTCGTCTGCGGTGATT-3’;小鼠GAPDH的上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。擴增條件為94℃5 min;94℃1 min，62℃1min，72℃1 min，共30個循環;72℃10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，凝膠成像系統分析目的基因與GAPDH條帶的相對吸光度值。

3.5可溶組分和非可溶組分分離細胞溶解于含5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、2%Triton X-100以及蛋白酶抑制劑的PBS(pH 7.4)緩沖液中，冰上孵育30 min，漩渦混勻10 min，14 000×g、4℃離心20 min，轉移上清至新的試管中，此為細胞可溶性組分。沉淀物加入一定量的SDS-PAGE上樣緩沖液，漩渦混勻20 min，100℃煮沸5 min，14 000×g室溫離心5 min，轉移上清液至新的試管中，即為細胞的非可溶性組分。

3.6免疫共沉淀與蛋白免疫印跡實驗結束后，立即將細胞用4℃預冷的PBS洗滌3次。細胞裂解液(含50 mmol/L Hepes，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10 mmol/L NaF，20 mmol/L sodium pyrophosphate，20 mmol/Lβ-glycerol phosphate，1 mmol/L sodium orthovanadate，10 mg/L leupeptin，10 mg/L aprotinin和1 mmol/L phenylmethanesulfonyl fluoride)裂解細胞，冰浴10 min，14 000×g、4℃離心10 min，Bradford法定量蛋白濃度，并調整各勻漿蛋白濃度一致。為進行免疫沉淀，細胞提取液與結合有特異性抗體的蛋白A瓊脂糖珠4℃共同孵育16 h，沉淀物用50 mmol/L HEPES緩沖液洗滌3次，最后加入2× SDS-PAGE上樣緩沖液95℃加熱5 min分離蛋白與瓊脂糖珠。為進行蛋白免疫印跡，細胞裂解液與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，95℃水浴5min，離心取上清行SDS-PAGE。蛋白免疫印跡的基本流程如下:恒壓100 V電泳，100 V、140 min電轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶封阻1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL顯色，VersaDoc Imaging System(Bio-Rad)獲得并分析結果。

4統計學處理

數據均采用均數±標準差(Mean±SD)表示，計量數據資料按Student t檢驗，計數數據按χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次以上。

結果

1泛素蛋白酶系統功能不足可抑制3T3-L1前脂肪細胞分化

硼替佐米(bortezomib，BZM)是一種有效的UPS抑制劑，為獲得其有效抑制脂肪細胞UPS功能的作用濃度，過度表達GFPu的3T3-L1前脂肪細胞分別接受5 nmol/L、10 nmol/L和20 nmol/L的BZM處理6 h。10 nmol/L和20 nmol/L濃度的BZM可有效提高GFPu的蛋白表達，表明該濃度BZM可抑制前脂肪細胞的UPS功能。為探討UPS功能對脂肪細胞分化的影響，3T3-L1前脂肪細胞在誘導分化期間的前3 d，持續接受10 nmol/L的BZM處理。結果表明，BZM處理顯著降低脂肪細胞中脂質和TG的含量;脂肪細胞標志蛋白aP2和脂聯素的mRNA表達水平也顯著降低，見圖1。這些結果表明:UPS功能抑制可抑制脂肪細胞的分化。

Figure 1.Bortezomib(BZM)suppressed the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.A:the effect of BZM on GFPu expression in 3T3-L1 pre-adipocytes;B:representative images of oil red O staining of adipocytes(×200);C:the effectof BZM on TG levels of adipocytes;D:the effect of BZM onmRNA levels of Adip and aP2 in adipocytes.GFPu:green fluorescence protein(GFP)family of ubiquitin-proteasome system reporters;TG:triglyceride;Adip:adiponectin;aP2:adipocyte protein 2.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs DMSO.圖1　硼替佐米抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化

2泛素蛋白酶系統功能激活可促進3T3-L1前脂肪細胞的分化

SDN可通過調節PKG而激活UPS［9］。20μmol/ L的SDN處理6 h可明顯降低3T3-L1前脂肪細胞中GFPu的表達，且該作用可以被BZM處理逆轉，表明SDN可促進脂肪細胞UPS的功能。已有文獻報道: SDN具有促進脂肪細胞分化的作用［10］。為研究SDN是否經激活UPS而誘導脂肪細胞的分化，3T3-L1前脂肪細胞在分化誘導期間，同時接受20μmol/ L的SDN和/或10 nmol/L的BZM處理6 d。結果發現:BZM可抑制SDN誘導的脂質和TG在細胞內的聚集;同時也可抑制SDN誘導的aP2和脂聯素mRNA表達增加，見圖2。這表明激活UPS可促進脂肪細胞的分化。

Figure 2.Sildenafil(SDN)promoted the differentiation of3T3-L1 pre-adipocytes.A:the effect of sildenafil on GFPu expression in 3T3-L1 pre-adipocytes;B:representative images of oil red O staining of adipocytes(×200);C:the effect of sildenafil on TG levels of adipocytes;D:the effect of sildenafil on mRNA levels of Adip and aP2 in adipocytes.GFPu:green fluorescence protein(GFP)family of ubiquitin-proteasome system reporters;BZM:bortezomib;TG:triglyceride;Adip:adiponectin;aP2:adipocyte protein 2.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs DMSO;##P＜0.01 vs SDN.圖2　西地那非促進3T3-L1前脂肪細胞的分化

3泛素蛋白酶系統調節PPARγ的表達

PPARγ在脂肪細胞的分化中具有關鍵作用［11］。為研究UPS活性對PPARγ表達的可能影響，分化誘導期第3天的3T3-L1前脂肪細胞接受10 nmol/L的BZM處理6 h。結果發現:BZM處理可降低細胞可溶組分中PPARγ的表達，而增加其在非可溶性組分中的表達，提示BZM可影響PPARγ的穩定性。本實驗結果同時發現:HSP90在可溶組分和非可溶組分中的表達模式與PPARγ表達相一致;此外，BZM處理明顯降低PPARγ與HSP90間的結合，見圖3。這些結果表明:HSP90在介導BZM穩定PPARγ的表達中具有重要作用。

Figure 3.Bortezomib(BZM)decreased PPARγexpression in soluble fraction.NIg:normal IgG;IP:immunoprecipitation.Mean± SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs DMSO.圖3　硼替佐米降低細胞可溶組分中PPARγ的表達

4HSP90參與泛素蛋白酶系統對脂肪細胞分化的調節

為闡明HSP90在介導UPS誘導脂肪細胞分化中的作用，3T3-L1前脂肪細胞誘導分化期間，同時接受20μmol/L的SDN和(或)20 nmol/L的HSP90特異性的N末端抑制劑GA處理。結果發現，GA可抑制SDN誘導的脂質和TG在細胞內的聚集;抑制SDN誘導的aP2和脂聯素mRNA表達的增加。同時，GA抑制了SDN所致的PPARγ表達的增加，見圖4。這些結果表明HSP90具有穩定PPARγ表達的作用，并由此介導UPS對脂肪細胞分化的影響。

Figure 4.Geldanamycin(GA)attenuated sildenafil(SDN)-induced differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.A:oil red O staining for observing the effectofGA on SDN-induced differentiation of3T3-L1 pre-adipocytes(×200);B:the effectofGA on TG expression in SDN-treated 3T3-L1 adipocytes;C:the effectof GA onmRNA levels of Adip and aP2 in SDN-treated 3T3-L1 adipocytes;D:the effects of SDN and GA on the expression of HSP90 and PPARγ.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs DMSO;##P＜0.01 vs SDN.圖4　格爾德霉素降低西地那非誘導的3T3-L1前脂肪細胞的分化

討論

UPS已被證明在晶狀體細胞的分化中起到重要作用［12］。在脂肪細胞中，蛋白酶功能的降低足以抑制脂肪細胞的分化，增加成熟脂肪細胞的氧化張力，影響脂肪細胞的衰老［6］。與這些研究結果相一致，本研究結果發現:在分化誘導期間，抑制UPS功能可阻礙脂肪細胞的分化;與此相反，誘導分化期間刺激UPS活性可促進脂肪細胞的分化，表明正常UPS功能是脂肪細胞分化所必需的。

PPARγ是影響脂肪細胞分化的重要因子，參與調節脂肪形成、能量平衡以及脂質生物合成［13］。在脂肪細胞分化的過程中，轉錄因子PPARγ通過激活其下游的靶基因，如CCAAT/增強子結合蛋白家族等而決定脂肪的生成和脂肪細胞的分化。眾多離體和在體的研究表明:激活PPARγ將刺激脂肪的生成和脂肪細胞的分化;而該因子的缺乏或活性的降低將導致相反的結果［13］。本研究發現:抑制UPS降低了細胞可溶性組分中PPARγ的含量，而增加了非可溶性組分中PPARγ含量。由于蛋白的可溶性是保障蛋白正常功能的基礎，而位于非可溶性組分中的蛋白易于被降解，因此本實驗結果提示UPS可能是通過調節PPARγ的水平而影響脂肪細胞的分化。

一般認為，PPARγ是UPS的作用底物。在一定條件下，處于增殖期的前脂肪細胞和成熟脂肪細胞中PPARγ可通過UPS介導降解［14］，而處于分化期的脂肪細胞中PPARγ表達相對穩定［5，15］。存在的問題是:何種機制導致分化期脂肪細胞中的PPARγ處于穩定狀態?蛋白質降解的主要方法包括UPS、細胞脂嗜、蛋白酶途徑等。其中，UPS的主要功能是清除細胞內錯誤折疊或未折疊蛋白，保持細胞內正常的蛋白平衡。分子伴侶HSP90具有穩定蛋白結構和功能的作用，可與PPARs類蛋白結合，并影響PPARs的正常折疊、穩定性和活性。例如，HSP90抑制PPARα和PPARβ的活性，但并不影響PPARα的穩定性和PPARγ的活性［15］。在3T3-L1細胞中，PPARγ的穩定主要受HSP90的保護［15］。HSP90通過與PPARγ結合保持了PPARγ的可溶性，避免其存在于非可溶組分中而被蛋白酶體降解［15］。當UPS被抑制時，泛素偶聯蛋白與HSP90的結合體出現在不可溶的組分中，由此增加泛素偶聯蛋白的不穩定性。本研究結果發現:在脂肪細胞分化期，抑制UPS功能降低了HSP90與PPARγ的結合、降低了細胞可溶性組分中PPARγ和HSP90的含量、增加了非可溶性組分中PPARγ和HSP90的含量，表明UPS功能降低可增加PPARγ的不穩定性，從而增強了PPARγ被其它非UPS途徑降解的可能。另一方面，抑制HSP90將破壞HSP90-PPARγ的結合，觸發PPARγ的不穩定性［15］。在本研究中表現為:HSP90特異性抑制劑GA降低SDN誘導的PPARγ蛋白量的增加，并由此阻止3T3-L1前脂肪細胞的分化。因此，適當提高UPS活性可維持分化中的脂肪細胞正常的蛋白平衡，減輕應激，增加PPARγ與HSP90結合，提高PPARγ的穩定性，刺激脂肪細胞的分化。

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Ubiquitin-proteasome system regulates adipogenic differentiation by stabilizing HSP90-dependent PPARγ

TANG Zhao，ZHANG Ye-min，LIMing-xin，WANG Chang-hua
(Department of Pathophysiology，Wuhan University School of Basic Medical Sciences，Wuhan 430071，China.E-mail: chwang0525@whu.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.021

1000-4718(2015)05-0888-06

2014-12-02［修回日期］2015-01-26

國家自然科學基金資助項目(No.30770758/H0178)

Tel:027-68759846;E-mail:chwang0525@wuh.edu.cn