燈盞花素對人視網膜色素上皮細胞和糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的影響*

王競男，楊立群，鄧宇斌△(中山大學附屬第一醫院轉化醫學中心，廣東廣州50080;中山大學化學與化學工程學院高分子研究所，廣東廣州5075)

燈盞花素對人視網膜色素上皮細胞和糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的影響*

王競男1，楊立群2，鄧宇斌1△
(1中山大學附屬第一醫院轉化醫學中心，廣東廣州510080;2中山大學化學與化學工程學院高分子研究所，廣東廣州510275)

目的:觀察燈盞花素對高糖環境下人視網膜色素上皮細胞株ARPE-19中VEGF、VEGFR2和p-ERK蛋白的表達及對2型糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的影響。方法:培養ARPE-19細胞，分為對照組、燈盞花素組、高糖組和高糖+燈盞花素組，ELISA檢測VEGF的分泌水平，Western blot檢測細胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平;取正常大鼠，隨機分為正常對照組、燈盞花素組、糖尿病模型組和糖尿病燈盞花素治療組，16周后取各組大鼠眼球，觀察大鼠視網膜的病理變化并評分，免疫組化觀察VEGF的表達情況。結果:(1)細胞實驗結果顯示，燈盞花素組VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平與正常對照組比較均減低(P＜0.05);高糖組細胞上述蛋白水平與正常對照組比較均增加(P＜0.05);高糖+燈盞花素組上述蛋白水平與高糖組比較表達均減少(P＜0.05); (2)大鼠視網膜病理學評分顯示糖尿病組與正常對照組、糖尿病燈盞花素治療組相比差異顯著，燈盞花素組與正常對照組相比差異無統計學意義。糖尿病大鼠與正常對照組、燈盞花素組相比，視網膜VEGF的表達增加;糖尿病燈盞花素治療組中VEGF的表達較糖尿病組有所降低(P＜0.05)。結論:燈盞花素可以降低ARPE-19細胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白表達水平，抑制糖尿病大鼠視網膜VEGF的表達，提示燈盞花素可能通過降低糖尿病大鼠視網膜細胞和組織中VEGF的表達，緩解其糖尿病視網膜病變進程。

燈盞花素;糖尿病視網膜病;血管內皮生長因子

［ABSTRACT］AIM:To evaluate the influence of scutellarin on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)in high glucose-treated human retinal pigmentepithelial cell line ARPE-19 and to observe the effects of scutellarin on the protein expression of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in the retinas of type II diabetic rats.METHODS:Cultured ARPE-19 cells were divided into normal control group，scutellarin group，high glucose group and high glucose+scutellarin group.The protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 weremeasured by Western blot.The VEGF release in ARPE-19 cells was detected by ELISA.Normal ratswere randomly divided into normal control group and scutellarin group.Diabetic ratmodelwas established by feeding with high-fat diet and injecting with streptozocin，and randomly divided into diabetes group and diabetes treated with scutellarin group.After 16 weeks，the eyes were removed.The morphological changes of the retinas were observed under lightmicroscope with HE staining，and histopathological score was recorded.The expression of VEGF in the retinaswas observed by themethod of immunohistochemistry.RESULTS:Compared with normal control group，the protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in the ARPE-19 cells decreased in scutellarin group，but increased in high glucose group.The histopathological score of the retinas showed significant difference among diabetes group，diabetes treated with scutellarin group and normal control group，and no significant difference between normal control group and scutellarin group was observed.The expression of VEGF increased in diabetic group and was significantly higher than that in scutellarin treatmentgroup(P＜0.05).CONCLUSION:Scutellarin inhibits the increased protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in ARPE-19 cells，and decreases the expression of VEGF in the retinas of diabetic rats.The suppression of the diabetic retinopathy development by scutellarin may be partly involved in the ERK/MAPK pathway.

［KEY WORDS］Scutellarin;Diabetic retinopathy;Vascular endothelial growth factors

糖尿病視網膜病變(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病引起的最嚴重的眼部并發癥，致盲性高［1-2］。多種病理機制參與DR的形成，其中以血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)為主的促血管生長因子在視網膜中過度表達是導致DR發生、發展的重要因素。糖尿病病理過程中的高糖和缺氧可以誘導視網膜中的視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞異常分泌VEGF，導致視網膜血管內皮細胞損傷，血管滲透性增加，毛細血管閉塞，從而促進視網膜的缺血和新生血管的形成［3-4］。此外，異常分泌的VEGF與其受體(主要是VEGFR2受體)結合后，激活MAPK/ERK信號通路，參與調節血管新生，導致新生血管形成增加，這也被認為是DR發病過程中的重要因素之一［5］。

燈盞花素(scutellarin)是從菊科屬植物短亭飛蓬全草燈盞細辛中提取的一類黃酮類成分，主要分為燈盞乙素(scutellarin-7-O-glucuronide)和燈盞甲素(apigenin-7-O-glucuronide)(分子結構式見圖1)，具有降低血液黏度、擴張血管、改善微循環以及抗氧化作用，目前已廣泛應用于心腦血管疾病和腎臟病變等疾病的治療［6-8］。Luo等［9］在2008年發現燈盞花素可以通過NF-κB通路抑制血管內皮細胞的炎癥; Chen等［10］在2006年發現燈盞花素可以通過抑制fractalkine來緩解缺氧性肺動脈高壓的發展，但其對VEGF、p-ERK和VEGFR2在RPE細胞上表達的影響還沒有報道。

Figure 1.Molecular structure of scutellarin.A:scutellarin-7-O-glucuronide;B:apigenin-7-O-glucuronide.圖1　燈盞花素的分子結構式

在本研究中，我們首先檢測了燈盞花素在高糖環境下對RPE細胞株ARPE-19中VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平的影響，然后通過燈盞花素治療2型糖尿病模型大鼠，進一步探討其在治療DR過程中的機制。

材料和方法

1實驗動物和材料

SPF級健康雄性SD大鼠，體質量200～250 g，由中山大學實驗動物中心生產供應部提供，合格證號為SYXK(粵)2011-0029。

DMEM培養基和胎牛血清(Gibco);VEGF抗體(Abcam);ERK、p-ERK、小鼠抗兔IgG和GAPDH抗體(Cell Signaling);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天); VEGF ELISA試劑盒(R＆D);免疫組化試劑盒(中衫金橋);鏈脲菌素(streptozotcin，STZ)購自Sigma;注射用燈盞花素購自四川杰象藥物有限公司。

2方法

2.1細胞培養及分組人視網膜上皮色素細胞ARPE-19細胞株從ATCC購得。培養液為含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的低糖DMEM培養液。細胞置于5%CO2、37℃培養箱中培養。ARPE-19細胞分為正常對照組、燈盞花素(5μmol/L)組、高糖(25.0 mmol/L葡萄糖)組和高糖+燈盞花素組，作用48 h后，收集細胞提取蛋白，收集上清，按照VEGF ELISA試劑盒的說明進行操作，最后在450 nm處檢測吸光度(A)值。

2.2實驗動物造模、分組和取材SD大鼠購進，適應環境1周后，喂以高脂飲食，其中碳水化合物45%，蛋白質15%，脂肪40%。高脂飲食喂養2個月后，隨機取20只大鼠，空腹12 h，以0.1%枸櫞酸鹽緩沖液配制2%的STZ溶液，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，正常對照組和燈盞花素組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，并繼續高脂喂養，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L者確定為糖尿病。成模當天作為實驗開始時間，將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組和糖尿病燈盞花素治療組。燈盞花素組和糖尿病燈盞花素治療組大鼠每日腹腔注射燈盞花素20 mg/kg，每天1次，處理16周，同期正常對照組和糖尿病組大鼠每日注射等量生理鹽水。各組大鼠處理16周后，過量麻醉處死大鼠，迅速摘除眼球，放入4%多聚甲醛溶液中固定，以備HE染色和免疫組化切片。

2.3免疫印跡法檢測細胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平收集細胞，用冰PBS洗3次，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，4℃15 000×g離心30 min，取上清;BCA法蛋白定量，電泳后轉至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，I抗(VEGF和VEGFR2為1∶500;p-ERK、ERK和GAPDH為1∶1 000)，4℃孵育過夜，II抗(HRP結合抗體為1∶1 000)，室溫孵育1 h，暗室孵育發光液、顯影。

2.4免疫組化方法、結果判定及病理評分取經4%多聚甲醛溶液固定后的眼球，于鋸齒緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節和玻璃體，余下的眼杯行全層石蠟包埋，5μm連續切片，常規脫蠟后和梯度乙醇水化后，進行HE和免疫組化染色，VEGF抗體稀釋度為1∶200，DAB顯色時間為5 min，顯色后，蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網膜組織的病理變化及VEGF陽性細胞表達情況。每例標本取6張切片，光鏡下每張切片任取5個高倍視野進行細胞計數，至少計數100個細胞，鏡下觀察出細胞呈棕褐色著色即為陽性表達細胞，輸入計算機后用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定視網膜VEGF陽性著色細胞個數，以陽性細胞占細胞總數的百分比表示陽性表達程度。

參照Kohno等［11］評分標準進行病理評分。每例標本取6張切片，光鏡下每個切片任取5個高倍鏡視野對視網膜病理改變進行評分，計量分析。視網膜病理評分標準為正常記0分;視桿細胞和視錐細胞的破壞記1～2分;外核層的破壞記3～4分;內核層的破壞記5～6分;神經節細胞層破壞記7分。

3統計學處理

所有實驗均獨立重復3次，統計學處理用SPSS 16.0統計軟件，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，行正態性分析及方差齊性檢驗，方差齊則行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1高糖、燈盞花素以及高糖聯合燈盞花素對ARPE-19細胞分泌VEGF的影響

與正常對照組相比，高糖引起ARPE-19細胞分泌VEGF顯著增多，燈盞花素引起ARPE-19細胞分泌VEGF減少，差異顯著(P＜0.05)。高糖+燈盞花素處理組的細胞分泌VEGF與單純高糖組相比有所減少，相對于單純高糖組差異都具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Scutellarin(SCU)inhibited the increased release of VEGF induced by high glucose.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖2　高糖以及燈盞花素對ARPE-19細胞分泌VEGF的影響

2高糖、燈盞花素以及高糖聯合燈盞花素對ARPE-19細胞VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平的影響

Western blot檢測發現，和正常對照組相比，燈盞花素組的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平均降低;單純高糖組的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平均增加，差異顯著(P＜0.05)。高糖+燈盞花素處理組相對于單純高糖組的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平降低，差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

3各組大鼠視網膜病理結構觀察

正常對照組大鼠視網膜內界膜完整，表面光滑，各層組織結構清晰;燈盞花素組大鼠視網膜病理結構和正常對照組大鼠無明顯差異;糖尿病組大鼠視網膜內界膜增生、紊亂，表面失光滑，血管腔面不規則擴張，腔內可見紅細胞分布，管壁變薄，可見未突出內界膜的新生血管芽;糖尿病燈盞花素處理組視網膜組織病變較糖尿病組輕，但仍然可見擴張不明顯的小血管，見圖4。視網膜病理評分顯示:正常對照組和燈盞花素組病理評分差異不顯著，但正常對照組和糖尿病組、糖尿病燈盞花素處理組病理評分相比差異有統計學意義(P＜0.05);糖尿病組和糖尿病燈盞花素處理組病理評分相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

4各組大鼠視網膜免疫組化檢測VEGF蛋白水平的變化

糖尿病組大鼠視網膜和正常對照組相比，VEGF表達明顯增加，糖尿病+燈盞花素處理組較糖尿病組的VEGF表達顯著減少(P＜0.05)，但正常對照組大鼠視網膜和燈盞花素組大鼠視網膜VEGF表達差異沒有統計學意義(P＞0.05)，見圖5。

Figure 3.The effects of high glucose and scutellarin(SCU)on the expression of VEGF，VEGFR2 and p-ERK in ARPE-19 cells.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖3　高糖以及燈盞花素對ARPE-19細胞VEGF、VEGFR2和p-ERK蛋白表達水平的影響

Figure 4.The pathological changes and scores of retinas of the diabetic rats treated with scutellarin(SCU).Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs diabetes.圖4　各組大鼠視網膜組織的病理變化和評分

Figure 5.The expression of VEGF in the retina of the diabetic rats treated with scutellarin(SCU).Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs diabetes.圖5　VEGF在各組大鼠視網膜組織中的表達

討論

糖尿病視網膜病變是糖尿病常見且不可逆轉的最嚴重的并發癥，主要引起視網膜微血管系統的損害，毛細血管腫脹變形，血-視網膜屏障破壞和視網膜新生血管形成［1］。一直以來，高血糖被認為是糖尿病視網膜病變的主要因素［12］。在糖尿病環境下，細胞內外糖濃度升高，末期糖基化產物累積增加，缺氧和氧化應激都可以引起RPE細胞分泌VEGF增多［13］。在DR的發生發展過程中，VEGF都是關鍵性的因子，VEGF可以增加視網膜內皮血管滲透性，又可以通過調控其它細胞因子，介導視網膜微血管滲漏，造成視網膜水腫;也可以介導視網膜血管內皮細胞的增殖，直接參與血管新生的過程。臨床研究證實DR患者的玻璃體液體中VEGF的含量明顯上升，并且與視網膜新生血管化的進程一致［14］，抑制VEGF的產生及其受體的過度表達可以延緩DR病變的發生發展［15］，因此可以抑制VEGF表達的藥物有望成為糖尿病視網膜病變的有效治療藥物。

燈盞花素是從燈盞花中提取的黃酮類有效成分，包括燈盞乙素和燈盞甲素，可擴張微動脈，減輕白細胞黏附性，降低血漿黏度，增強組織灌注，改善微循環代謝，已廣泛應用于心腦血管疾病及腎病等微循環性疾病［7，10］。

本實驗通過觀察燈盞花素對ARPE-19細胞和糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的影響，來探討燈盞花素抑制糖尿病視網膜病變的作用機制。通過ELISA檢測各組VEGF的分泌，發現ARPE-19細胞在高糖環境下VEGF的分泌顯著增加，燈盞花素組的細胞分泌VEGF與正常對照組相比有所減少，高糖+燈盞花素處理組的細胞分泌VEGF與單純高糖組相比有所減少。VEGF有2種受體(VEGFR1和VEGFR2)，其中VEGFR2，又稱FLK-1，存在于血管和淋巴管內皮等處，在生理和病理血管新生中，VEGFR2均是主要的信號轉導蛋白，通過自身磷酸化，觸發下游一系列信號通路促進血管的發生。VEGF可與VEGFR2結合，經MAPK通路，激活ERK1/2，參與調解血管新生。Western blot實驗表明，燈盞花素不但抑制正常環境下ARPE-19細胞的VEGF過表達，還可以抑制其受體VEGFR2的表達及其下游ERK的磷酸化。以上結果提示燈盞花素在正常環境下即對ARPE-19細胞VEGF及其受體VEGFR2下游相關蛋白即有抑制作用，因此燈盞花素對ARPE-19細胞VEGF分泌及其受體VEGFR2下游相關蛋白的作用是否與高糖環境相關還有待進一步的實驗研究。

大量的研究報道了糖尿病視網膜病變后，視網膜組織結構增生、紊亂，毛細血管內皮細胞腫脹變形，新生小血管增多，新近的研究還發現，視網膜組織中的VEGF沉積量與視網膜的病變程度成正比［1，4］。為了進一步驗證體外實驗的結果，我們通過腹腔注射STZ后給予高糖飲食構建了大鼠糖尿病模型。HE和免疫組化染色發現在對照組視網膜中，血管新生增加，表面失光滑，結構紊亂，證實了大鼠糖尿病模型存在嚴重的視網膜病變。在糖尿病燈盞花素治療組中，燈盞花素可以明顯減輕糖尿病所致的視網膜病變，可以顯著減少VEGF在視網膜中的沉積，并且糖尿病燈盞花素處理組大鼠視網膜的病理評分和糖尿病組大鼠視網膜的病理評分差異顯著，這些結果提示燈盞花素可能通過降低VEGF的表達，減少VEGF和VEGFR2的結合，阻止MAPK通路的激活，從而減少血管的新生，達到延緩糖尿病視網膜病變進程。但燈盞花素組大鼠視網膜和正常對照組大鼠視網膜的病理評分和VEGF沉積量差異并沒有統計學意義，提示燈盞花素對正常狀態下大鼠視網膜的影響并不大，與離體細胞實驗的結果不完全一致，這究竟是由于人的細胞與鼠的視網膜組織之間存在種系差異還是由于本實驗中樣本例數較少，有待進一步證實。

總之，上述結果提示燈盞花素在正常環境下即對ARPE-19細胞VEGF及其受體VEGFR2下游相關蛋白即有抑制作用，但燈盞花素能夠減低糖尿病大鼠視網膜VEGF的含量，延緩糖尿病視網膜病病程，因此其在預防和治療糖尿病視網膜方面有一定的應用前景，對將其應用于預防和治療糖尿病視網膜病變方面還需大量的臨床隨機對照研究才能造福于病人。

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Effect of scutellarin on VEGF expression in human retinal pigment epithelial cells and retinas of diabetic rats

WANG Jing-nan1，YANG Li-qun2，DENG Yu-bin1
(1Research Center of TranslationalMedicine，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;2Institute of Polymer Science，School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China.E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.023

1000-4718(2015)05-0900-06

2015-01-08［修回日期］2015-03-11

廣東省教育部產學研結合項目(No.2012B091100457)

Tel:020-87755766;E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn