不同年齡女性人群血液中的Dkk-1水平與骨密度相關性的分析研究*

蔣笑，侯大標，吳文銳，馮仕彪，查振剛(暨南大學附屬第一醫(yī)院骨關節(jié)科，廣東廣州510632)

不同年齡女性人群血液中的Dkk-1水平與骨密度相關性的分析研究*

蔣笑，侯大標，吳文銳，馮仕彪，查振剛△
(暨南大學附屬第一醫(yī)院骨關節(jié)科，廣東廣州510632)

目的:探討不同年齡女性人群血液中的Dickkopf-1(Dkk-1)水平與骨密度之間的相關性。方法:選取2013年3月～2014年6月在我院行體檢的100例年齡處于20～80歲之間的女性志愿者，按照不同年齡分為青年組(20～39歲)、中年組(40～59歲)和老年組(60～80歲)，從中年女性組中抽取45～55歲25人，分為絕經(jīng)期女性組和未絕經(jīng)女性組。采用酶聯(lián)免疫吸附法測3組志愿者血清Dkk-1的表達水平，采用雙能X線骨密度測量儀測定3組志愿者全身礦含量，分析不同年齡女性以及絕經(jīng)與否女性血清Dkk-1水平的差異及Dkk-1水平與骨密度的關系。結果:隨著年齡的增長，人群血清Dkk-1水平相應增高(P＜0.05)，骨密度相應降低(P＜0.05);3組志愿者中，血清Dkk-1水平與骨密度均呈負相關(P＜0.05)。45～55歲年齡范圍內(nèi)，絕經(jīng)組女性血清Dkk-1與未絕經(jīng)婦女相比，Dkk-1水平與骨密度降低的相關性更為密切(P＜0.05)。結論:人體隨著年齡的增加，血清Dkk-1水平會上升，并出現(xiàn)骨密度下降，有發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的風險。相同年齡范圍婦女中，絕經(jīng)后婦女Dkk-1水平表達較高，骨密度降低更明顯，有更大的發(fā)生骨質(zhì)疏松癥危險。Dkk-1表達的增加同時可抑制骨形成和促進骨吸收，有望成為預防和治療骨質(zhì)疏松癥治療的一個新靶點。

年齡;女性;Dickkopf-1;骨密度

［ABSTRACT］AIM:To conduct the relevance analysis of serum Dickkopf-1(Dkk-1)and bone mineral density (BMD)in the different ages of female populations.METHODS:The women volunteers(n=100，20～80 years old) were selected and divided into young group(20～39 years old)，middle age group(40～59 years old)and elderly group (60～80 years old).The serum levels of Dkk-1 in the 3 groups of volunteerswere detected by ELISA.In themiddle age group，25 people of45～55 years old were selected and divided into postmenopausal group and premenopausal group to detect the serum levelof Dkk-1 in the2 groups of volunteers by ELISA.The BMD wasmeasured by themethod of dual energy X-ray absorptiometry.The differences of Dkk-1 expression levels among different ages of female populations，and the relevance with BMD were compared.RESULTS:With the increase in age，the serum Dkk-1 expression level increased(P＜0.05)，and BMD were reduced(P＜0.05).The blood levelof Dkk-1 and BMD negatively correlated(P＜0.05)in the 3 groups of volunteers.The serum levels of Dkk-1 and BMD had stronger negative correlation in postmenopausalwomen group than that in premenopausal women group.CONCLUSION:With the increase in age，the expression level of serum Dkk-1 increases and the BMD level decreases，which contribute to a risk of osteoporosis.In the same age range，the postmenopausal women express higher level of Dkk-1，and the decreased BMD ismore obvious，which contribute to a greater risk of osteoporosis.The increased level of Dkk-1 also inhibits bone formation and promotes bone resorption.Itmay become a new target for preventing and treating osteoporosis.

［KEY WORDS］Age;Female;Dickkopf-1;Bonemineral density

人體的骨代謝是一個包括成骨和破骨的動態(tài)平衡過程，隨著年齡和雌激素的變化，會導致各種信號通路效能的增強或降低，從而使成骨細胞與破骨細胞的增殖分化紊亂，當成骨細胞增殖分化受到抑制而破骨細胞增強的時候，可能會出現(xiàn)骨代謝失衡。骨代謝失衡可導致人體骨密度(bonemineral density，BMD)減少和骨結構異常，進而表現(xiàn)骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)破壞［1］。近年來，治療骨質(zhì)疏松癥的分子靶向藥物有了長足的發(fā)展。隨著分子靶向藥物的興起，調(diào)控骨質(zhì)平衡的各種通路的研究也不斷深入。分泌型糖蛋白Wnt信號通路與骨形成關系密切，Dickkopf-1 (Dkk-1)是Wnt途徑重要的調(diào)控分子，目前研究認為Dkk-1通過阻斷Wnt信號向胞內(nèi)傳遞，從而使骨形成減少［2］。同時有研究發(fā)現(xiàn)Dkk-1可促進破骨細胞分化因子的表達，從而增加破骨細胞數(shù)量和活性［3］。因此Dkk-1在人體骨代謝過程中起骨形成抑制作用和骨破壞促進作用。本研究主要通過分析不同年齡女性人群之間血清Dkk-1水平的差異，以及Dkk-1水平與骨密度的相關性，為Dkk-1單克隆抗體應用于治療骨質(zhì)疏松的臨床試驗提供理論基礎。

材料和方法

1一般資料

選取2013年3月～2014年6月在我院行體檢的女性志愿者100例，年齡20～80歲，平均年齡(54.58±6.39)歲，平均身高(1.61±0.04)m，平均體重(51.26±2.82)kg，平均體重指數(shù)為(27.13± 1.26)kg/m2。其中年齡20～39歲34人，設為青年組;年齡40～59歲35人，設為中年組;年齡大于60歲31人，設為老年組。所有患者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)我院醫(yī)藥倫理委員會審批通過;排除患有心、肝、腎及血液系統(tǒng)疾病者，伴有糖尿病或甲狀腺功能亢進等影響骨代謝的慢性疾病者，體檢前半年內(nèi)曾使用過激素類或影響骨代謝的其它藥物者。

2研究方法

Dkk-1及骨密度的水平的測定遵循雙盲原則。所有志愿者均于體檢當天清晨抽取空腹肘靜脈血，并于2周后再次抽血，以1 000 r/min速率在4℃條件下離心5 min后分離并提取血清，分裝于EP管后置于－80℃冰箱凍存待用，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清Dkk-1的濃度，Dkk-1試劑盒購自R＆D，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用雙能X線骨密度測量儀(Hologic.)測量所有志愿者腰L2～4、股骨頸(neck)、股骨大轉子(trochiter)和Ward’s三角區(qū)部位的BMD(g/cm2)，最終記錄2次檢測后的平均值。整個測量過程由計算機軟件控制自行定位、測量、處理分析數(shù)據(jù)并打印數(shù)據(jù)，重復測定的變異系數(shù)為0.5%。

3統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)核對證實后均經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，采用Pearson相關分析方法分析血液Dkk-1水平與骨密度的相關性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1不同年齡女性人群各個部位BMD的差異

3組志愿者的BMD兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，從數(shù)據(jù)可知，隨著年齡的增長，人體各個部位BMD降低。中年組志愿者各個部位BMD明顯較青年組志愿者降低，老年組志愿者各個部位BMD降低幅度進一步加大，見表1。

表1　不同年齡女性人群各個部位的BMDTable 1.The BMD of different regions of the body in young group，middle age group and elderly group(g/cm2.Mean±SD)

2不同年齡女性人群血清Dkk-1水平的差異

3組志愿者血清Dkk-1的表達兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，以老年組表達最高，其次為中年組，最低為青年組，隨著年齡的增長，人群血清Dkk-1水平相應增高，見表2。

表2　不同年齡女性人群血清Dkk-1水平Table 2.The serum Dkk-1 level in different ages ofwomen(ng/ L.Mean±SD)

3不同年齡女性人群血清Dkk-1水平與全身骨礦含量(total body bone m ineral content，TBBMC)的相關性

3組志愿者中，血清Dkk-1水平與TBBMC均呈負相關(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The correlation between serum Dkk-1 level and TBBMC in young group，middle age group and elderly group.圖1　不同年齡女性人群血清Dkk-1水平與全身骨礦含量的相關性分析

4相同年齡范圍內(nèi)絕經(jīng)和未絕經(jīng)女性血清Dkk-1水平與TBBMC的相關性

從中年志愿者抽取的45～55歲(n=25)2組志愿者血清Dkk-1水平與TBBMC均呈負相關(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The correlation between serum Dkk-1 level and TBBMC in postmenopausal group and premenopausal group ofmiddle age.圖2　中年組內(nèi)絕經(jīng)和未絕經(jīng)人群血清Dkk-1水平與全身骨礦含量的相關性分析

討論

正常人骨骼系統(tǒng)新陳代謝過程中，破骨細胞的骨吸收作用與成骨細胞的骨形成作用處于動態(tài)平衡，這兩者的增殖分化又受到了各種因素如信號通路的調(diào)控。因各種因素，如年齡、激素導致信號通路的紊亂，出現(xiàn)破骨細胞的骨吸收作用大于成骨細胞的骨形成作用，則可導致骨量減少，骨密度下降，最終會發(fā)展成為骨質(zhì)疏松癥［4］。骨質(zhì)疏松癥可導致人體骨質(zhì)脆性增加，可以導致疼痛，也會大大增加骨折風險，已有多項研究報道，約20%骨質(zhì)疏松性骨患者骨折后死亡，而將近40%骨質(zhì)疏松性骨折患者骨折后生活不能自理，嚴重影響患者生活質(zhì)量［5］。

目前臨床上應用于治療骨質(zhì)疏松的藥物多種多樣，但除輔助藥物以外更多抑制破骨細胞活性，只有少數(shù)藥物增強成骨細胞活性，例如激素類藥物，國內(nèi)已有學者初步證明雌激素可以同時作用于成骨與破骨細胞，使骨量增加，促進骨折的愈合，但其臨床價值還需要進一步研究［6］。即便是作用于成骨細胞，其藥物的靶點也不相同。隨著骨重塑的分子生物學的不斷發(fā)展，調(diào)控骨重建的多條信號轉導通路被不斷發(fā)現(xiàn)、研究，例如:調(diào)控破骨細胞的信號轉導通路有RANKL/RANK信號通路、整合素(integrin)αv、β3信號通路等;調(diào)控成骨細胞的信號轉導通路有Wnt/β-catenin信號通路、鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，CaSR)信號通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenic protein，BMP)信號通路等。隨著信號通路認識的不斷深入，很多專家根據(jù)這些信號轉導通路研發(fā)了多種新的治療骨質(zhì)疏松癥的靶向藥物。分子靶向藥物通過信號靶向機制增強成骨細胞的增殖分化，既保證成骨細胞活性也增加成骨細胞的數(shù)量，即“保質(zhì)保量”，所以這類藥物有較大的發(fā)掘潛力。值得一提的是，促進成骨細胞功能藥物在抗骨質(zhì)疏松的同時也能促進骨質(zhì)疏松并發(fā)骨折的愈合［7］。

在調(diào)控成骨細胞增殖、分化的信號通路中，研究得較為透徹的是Wnt信號通路，Wnt信號通路在成骨細胞的發(fā)育、分化及骨形成作用中起關鍵作用［8］，Dkk-1對Wnt信號通路起負向調(diào)控作用［9］。Dkk-1是一種分泌性糖蛋白，可通過與低密度脂蛋白受體5/6(Lrp5/6)和另一類穿膜蛋白Kremen1/2結合形成三聚體，使得細胞外Wnt配體不能與Lrp5/6結合，從而抑制與骨形成相關的Wnt信號轉錄，進而阻斷成骨細胞的分化及骨形成作用，使骨形成減少［10］。

有研究發(fā)現(xiàn)，Dkk-1可增加巨噬細胞集落刺激因子等促進破骨細胞分化因子的表達，進而增加破骨細胞數(shù)量和活性，促進骨吸收作用，因此Dkk-1表達的增加不僅可抑制成骨細胞的骨形成作用，還可促進破骨細胞的骨吸收作用［11］。已有多項動物模型試驗證實Dkk-1是BMD的調(diào)控因子之一［12］。章瑜等［13］通過建立Dkk-1沉默的小鼠U266細胞，研究得出，U266細胞中Dkk-1基因沉默后，其培養(yǎng)上清抑制小鼠前成骨細胞MC3T3-E1成骨分化的能力減弱。從另一個角度證實了Dkk-1對于干細胞向成骨細胞分化的抑制作用。Dkk-1的發(fā)現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新思路，通過制備相關Dkk-1抗體干擾Dkk-1的表達，提高Wnt信號通路的活性，進而促進成骨細胞的骨形成作用從而增加BMD［14］。Dkk-1有望成為骨質(zhì)疏松治療的一個靶點［15］。大量臨床和基礎實驗研究得出結論，年齡的增長對骨密度產(chǎn)生影響［16］，本研究結果也顯示，隨著年齡的增長，女性群體血清Dkk-1的表達水平升高，而骨密度降低，尤其是老年人群BMD降低更明顯。同時本研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡女性人群中血清Dkk-1水平與骨密度呈負相關，且年齡越大，兩者相關性越強，表明年齡和血清Dkk-1水平均是骨密度的影響因素。隨著女性群體年齡的增長，尤其是絕經(jīng)后(一般認為女性絕經(jīng)時間在45～55歲)，雌激素降低導致骨質(zhì)保護作用減弱、飲食及活動減少等各方面原因會導致骨密度降低［17］。之前有許多學者通過男性、女性的多角度，對于年齡、Dkk-1和骨密度的關系的研究證實了Dkk-1是導致骨密度下降的重要分子因素［18］。本研究結果不僅提示了年齡與Dkk-1高表達密切相關且導致骨密度降低(相同BMD水平，老年組人群血清Dkk-1水平較中年組和青年組高，提示老年女性人群是骨質(zhì)疏松癥高危人群)。此外，在相同年齡組(中年組)中，在盡量排除年齡因素后(45～55歲)，未絕經(jīng)女性Dkk-1表達水平較低，骨密度下降相對緩慢。絕經(jīng)女性DKK1表達較高，且骨密度下降相對劇烈，即Dkk-1與骨密度下降的相關性更加密切。這也證實了絕經(jīng)對于女性骨量起到了加劇丟失的作用。因此，對于中老年人，尤其是絕經(jīng)后高齡婦女，應注意骨質(zhì)疏松癥的防治，采取各種適合自身的干預措施以減少骨質(zhì)的吸收和增加骨形成，從而減少或延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生。但目前用于治療骨質(zhì)疏松癥的Dkk-1抗體的臨床試驗尚未開展。本研究主要在臨床層面分析Dkk-1與骨質(zhì)疏松癥的相關性，確定Dkk-1為骨質(zhì)疏松治療的新靶點地位，通過應用Dkk-1單克隆抗體阻斷Dkk-1的表達可能成為骨質(zhì)疏松癥的治療方法。必須指出的是，Dkk-1抗體仍然要解決特異性的問題，其對骨骼外其它器官的毒副作用是今后研究的關鍵［19］。

綜上所述，人群骨密度受年齡、激素等影響，有可能會導致信號通路的紊亂，如Dkk-1高表達會對Wnt信號造成負向調(diào)控。而血清中Dkk-1水平與骨密度呈負相關，這種聯(lián)系為骨質(zhì)疏松癥的預防、診斷和治療提供了新思路，即可通過抑制Dkk-1的表達，促進骨形成，減緩骨量的丟失，這也有望成為骨質(zhì)疏松治療的一個新靶點。

人體骨骼發(fā)育在達到一定的峰值后，骨密度下降是不可避免的，本研究固然是想通過信號通路的靶點，為分子靶向藥物治療骨質(zhì)疏松癥奠定理論基礎，但也同樣著眼于骨密度下降和骨質(zhì)疏松癥的預防。對骨質(zhì)疏松癥研究的目的，不僅僅是為了在嚴重骨質(zhì)疏松癥的情形下采取被動的應對措施，我們更應該用發(fā)展的觀點，將其作為骨密度變化的連續(xù)過程來看待。如果在骨密度下降早、中期就能找到相關的調(diào)控點，那么對于骨質(zhì)疏松癥的防治也能起到一定的作用。所以，下一步的研究主要是加大研究人群數(shù)量和范圍(尤其是絕經(jīng)期婦女)，以便進一步了解Dkk-1水平能否作為一個敏感的診斷指標，并通過這個指標，能夠早期預防骨密度的下降，并最終延緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。

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Relevance analysis of serum Dkk-1 expression and bonem ineral density in different ages of female populations

JIANG Xiao，HOU Da-biao，WUWen-rui，F(xiàn)ENG Shi-biao，ZHA Zhen-gang
(Department of Orthopaedics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:263784833 @qq.com)

R392.12

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.024

1000-4718(2015)05-0906-05

2015-01-15［修回日期］2015-04-28

國家自然科學基金資助項目(No.81472089)

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