羅格列酮通過抑制RANKL及p-ERK活化抑制類風濕關節(jié)炎破骨細胞的分化及功能*

韋秀寧，鄭東輝，莫穎倩，馬劍達，戴冽(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院風濕免疫科，廣東廣州510120)

羅格列酮通過抑制RANKL及p-ERK活化抑制類風濕關節(jié)炎破骨細胞的分化及功能*

韋秀寧，鄭東輝，莫穎倩，馬劍達，戴冽△
(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院風濕免疫科，廣東廣州510120)

目的:探討羅格列酮(RSG)對類風濕關節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細胞(FLS)介導的破骨細胞(Oc)分化及功能的影響及其可能機制。方法:活動期RA患者滑膜體外分離培養(yǎng)FLS，與健康人外周血單核細胞(MNC)共培養(yǎng)，不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)干預，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鑒定Oc并計數(shù);甲苯胺藍染色和圖像分析系統(tǒng)計算骨吸收陷窩面積;Real-time PCR檢測共培養(yǎng)體系RANKL和OPG的mRNA表達，Western blot檢測RANKL、OPG、p-ERK、p-p38和p-JNK的蛋白含量。結果:與不加RSG組比較，15μmol/L RSG干預后Oc的數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，骨吸收陷窩面積也減少(P＜0.05);共培養(yǎng)體系RANKL的mRNA及蛋白表達明顯降低，OPG的mRNA及蛋白表達明顯升高(P＜0.01);p-ERK的蛋白含量明顯降低(P＜0.05)，p-p38及p-JNK的蛋白含量則不受影響。結論:RSG通過抑制RANKL及p-ERK活化影響RA關節(jié)微環(huán)境中組織細胞與免疫細胞的相互作用，從而抑制Oc分化及骨吸收功能。

類風濕關節(jié)炎;成纖維樣滑膜細胞;破骨細胞;核因子κB受體活化因子配體;過氧化物酶體增殖物活化受體γ

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effects of rosiglitazone on fibroblast-like synoviocyte(FLS)-induced osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis(RA)and the related mechanism.METHODS:RA-FLSwere cocultured with peripheral blood monocytes from healthy volunteers in the presence ofmacrophage colony-stimulating factor(M-CSF)and rosiglitazone.Osteoclasts were assayed by tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)staining.Resorption lacunae area was identified by toluidine blue staining and quantified by image analysis software.ThemRNA expression of RANKL and OPG was evaluated by real-time PCR，and the protein levels of RANKL，OPG，p-ERK，p-p38 and p-JNK weremeasured by Western blot.RESULTS:Compared with controlgroup(without rosiglitazone treatment)，rosiglitazone at concentration of15μmol/L significantly decreased the number of osteoclasts(P＜0.01)and resorption lacunae area(P＜0.05).The expression of RANKL atmRNA and protein levels was significantly down-regulated by rosiglitazone at concentration of 15 μmol/L，while themRNA and protein expression of OPG was up-regulated(P＜0.01).Rosiglitazone(15μmol/L)significantly decreased the protein level of p-ERK(P＜0.05)，but not the protein level of p-p38 or p-JNK(P＞0.05).CONCLUSION:Rosiglitazone inhibits RA-FLS-induced osteoclast formation and its resorption activity by down-regulating RANKL expression and ERK phosphorylation，suggesting that rosiglitazonemay inhibit RA osteoclastogenesis and bone resorption.

［KEY WORDS］Rheumatoid arthritis;Fibroblast-like synoviocytes;Osteoclast;Receptor activator of nuclear factor-κB ligand;Peroxisome proliferator-activated receptorsγ

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關節(jié)破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫病。控制炎癥、阻斷關節(jié)骨破壞是治療RA的目標。過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ是一類配體依賴性核轉錄因子，具有抗炎、抗腫瘤及胰島素增敏等多種功能，在炎癥和免疫反應中起重要作用［1］。最新研究發(fā)現(xiàn)巴基斯坦人群中RA患者PPAR基因型Pro12Ala GG表達率顯著高于健康人群，提示PPARγ基因變異可能與RA發(fā)病相關［2］。基礎及臨床研究已證實PPARγ活化在RA中具有抗炎作用［3-4］。然而PPARγ對破骨細胞(osteoclast，Oc)分化及骨吸收功能的調控作用尚不明確。國內一項對198例糖尿病患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，使用具有上調PPARγ作用的噻唑烷二酮類藥物2年以上的女性患者骨密度下降幅度顯著高于未用該類藥物的女性患者，而在男性患者中卻出現(xiàn)相反的結果［5］。因此，本文擬采用共培養(yǎng)體系觀察羅格列酮(rosiglitazone，RSG)對模擬RA關節(jié)組織細胞與免疫細胞相互作用下成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)誘導Oc分化及骨吸收過程的影響，探討其對RA患者Oc分化及骨吸收功能的調控作用及可能機制。

材料和方法

1研究對象及材料

滑膜標本來源及對象:確診活動期RA患者細針滑膜活檢獲取膝關節(jié)滑膜，RA診斷符合1987年美國風濕病協(xié)會(ACR)修訂的診斷標準或2009年ACR與歐洲風濕病學會(EULAR)聯(lián)合修訂的RA分類標準。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準。

鼠抗人波形蛋白(vimentin)單抗和鼠抗人肌酸激酶(creatine kinase，CK)單抗(北京中杉金橋公司);鼠抗人CD3、CD14和CD55單抗(BD);重組人巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和鼠抗人核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)單抗(R＆D);鼠抗人骨保護素(osteoprotegerin，OPG)單抗(Imgenex);兔抗人p-ERK、p-p38及p-JNK單抗(CST);Quant SYBR Green PCR kit(TaKa-Ra);抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒(Sigma);骨片(Nordic Bioscience);羅格列酮(Biovision)。

2方法

2.2外周血單核細胞(monocyte，MNC)的分離、純化及鑒定淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離健康人外周血單個核細胞，貼壁純化后流式細胞術CD14、CD3雙色熒光標記抗體檢測MNC的純度［7］。

2.3CCK-8比色法檢測RSG對共培養(yǎng)體系細胞活性的影響RA-FLS(1×103cells/well)與MNC(3× 105cells/well)在含25μg/L M-CSF、20%胎牛血清及不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，分別于0、1、3、5、7、14和21 d終止培養(yǎng)，加入CCK-8孵育3 h，酶標分析儀492 nm波長下測定吸光度(A)值，根據(jù)每組各孔測得的A值計算出平均值。實驗重復3次。

2.4TRAP染色檢測RSG對Oc分化的影響RAFLS與MNC在含25μg/LM-CSF、20%胎牛血清及不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，14 d時行TRAP染色，按說明書操作，光鏡下觀察結果并計數(shù)，TRAP染色陽性(胞質內有均勻的酒紅色顆粒沉積)且細胞核≥3個的細胞為Oc。

2.5骨圓盤法檢測RSG對Oc骨吸收功能的影響RA-FLS與MNC在預置了骨片的96孔板中加入含25μg/L M-CSF、20%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液共培養(yǎng)14 d，第15天始加入不同濃度RSG(0和15 μmol/L)干預，第21天取出骨片，沖洗干凈后梯度乙醇脫水，1%甲苯胺藍染色3 min，相差顯微鏡觀察骨吸收陷窩情況，骨吸收陷窩被染為藍色，呈蟲噬樣，形態(tài)不規(guī)則，邊界清晰。圖像分析系統(tǒng)計算骨吸收陷窩面積。

2.6Real-time PCR檢測RSG對共培養(yǎng)體系RANKL和OPGmRNA的影響RA-FLS與MNC在含25μg/ L M-CSF、20%胎牛血清及不同濃度RSG(0和15 μmol/L)的α-MEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)14 d，提取總RNA，合成cDNA。RANKL的上游引物序列為5’-ACCAGCATCAAAATCCCAAG-3’，下游引物序列為5’-CCCCAAAGTATGTTGCATCC-3’;OPG的上游引物序列為5’-TGCTGTTCCTACAAAGTTTACC-3’，下游引物序列為5’-CTTTGAGTGCTTTAGTGCGTG-3’;β-actin的上游引物序列為5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’，下游引物序列為5’-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’。PCR反應條件為預變性95℃30 s;95℃5 s、60℃30 s，擴增40～50個循環(huán)。2－ΔΔCt法計算RANKL和OPGmRNA相對表達量。

2.7Western blot檢測RSG對共培養(yǎng)體系RANKL、OPG、p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白含量的變化RAFLS與MNC共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同real-time PCR，14 d后提取總蛋白，10%SDS-PAGE、電轉、封閉，分別孵育RANKL(1 mg/L)、OPG(1 mg/L)、β-actin(1∶500稀釋)、p-ERK(1∶2 000稀釋)、p-p38及p-JNK(均為1∶1 000稀釋)I抗和II抗后ECL發(fā)光液化學發(fā)光，X光顯影。采用Quantity One軟件進行掃描定量，取目的蛋白條帶吸光度值(A/mm2)與內參照蛋白吸光度值(A/mm2)的比值來表示蛋白的相對定量。實驗重復3次。

3統(tǒng)計學處理

近些年來，玉米種植區(qū)玉米粗縮病發(fā)病面積一直上升，危害逐年加重，成為玉米生產(chǎn)的主要病害之一。通過近些年對玉米粗縮病發(fā)生的影響因素做了分析，了解了玉米粗縮病的發(fā)生原因，并找到了防治該病的有效措施。

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示;兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗或秩和檢驗;多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1RA-FLS的原代培養(yǎng)及鑒定

光鏡下可見所培養(yǎng)的細胞呈梭形，細胞核呈卵圓形，位于細胞中央，核仁清晰，電鏡下可見核染色質較疏松，呈細顆粒狀分布在核周圍，核仁明顯，粗面內質網(wǎng)豐富，胞漿突起長而粗，胞漿中往往缺乏高爾基復合體，可見少量小泡和囊泡。呈vimentin+/ CK+/CD68－，流式細胞術檢測CD55+細胞百分率約(95.34±2.47)%，純度＞95%。

2MNC鑒定

分離的健康人外周血單個核細胞貼壁純化后，采用流式細胞術檢測MNC的純度，結果顯示貼壁細胞表面CD14+CD3－細胞比率為93.71%，表明MNC純度＞90%。

3RSG對共培養(yǎng)體系細胞活性的影響

不同濃度RSG(0、5、10和15μmol/L)分別干預RA-FLS與單核細胞共培養(yǎng)體系0、1、3、5、7、14、21 d，CCK-8法檢測各組不同時點的A值，結果顯示在同一時點，不同濃度RSG(5、10和15μmol/L)組分別與對照組相比，A值無統(tǒng)計學差異，提示本研究使用的RSG濃度(5、10和15μmol/L)對共培養(yǎng)體系細胞無毒性作用，不影響細胞活性。

4RSG對RA-FLS誘導的Oc分化的影響

RA-FLS與MNC共培養(yǎng)14 d時行TRAP染色，0 μmol/LRSG組可見大量TRAP+且核≥3個的Oc，5、10μmol/L RSG組與0μmol/L RSG組相比Oc數(shù)量無明顯變化，15μmol/L RSG組Oc數(shù)量較0μmol/L RSG組明顯減少(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of rosiglitazone(RSG)on RA-FLS-induced osteoclastogenesis(TRAP staining，×200).Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs0μmol/L RSG.圖1　RSG對RA-FLS誘導的Oc分化的影響

5RSG對RA-FLS誘導的Oc功能的影響

甲苯胺藍染色示0、15μmol/L RSG組均見清晰的骨吸收陷窩形成，圖像分析結果示15μmol/L RSG組骨吸收陷窩面積較0μmol/L RSG組明顯減少(P＜0.05)，見圖2。

6RSG對共培養(yǎng)體系RANKL和OPG m RNA及蛋白表達的影響

15μmol/L RSG干預RA-FLS與MNC共培養(yǎng)體系14 d后，RANKL的mRNA及蛋白表達較0μmol/ L RSG組明顯降低(P＜0.01)，而OPG的mRNA及蛋白表達則明顯上調(P＜0.01)，RANKL/OPG的mRNA及蛋白比率明顯降低(P＜0.01)，見圖3、4。

Figure 2.The effect of rosiglitazone(RSG)on RA-FLS-induced osteoclast function(toluidine blue staining，×200).Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs0μmol/L RSG.圖2　RSG對RA-FLS誘導的Oc功能的影響

Figure 3.The effect of rosiglitazone(RSG)on RANKL and OPG mRNA expression in RA-FLS and monocyte coculture system.Mean±SD.n=3.△△P＜0.01 vs 0μmol/L RSG.圖3　RSG對共培養(yǎng)體系RANKL及OPG mRNA表達的影響

7RSG對共培養(yǎng)體系絲裂原活化蛋白激酶(m itogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路的影響

RA-FLS與MNC共培養(yǎng)，15μmol/L RSG干預14 d后，Western blot結果顯示p-ERK的蛋白含量較0μmol/L RSG組明顯降低(P＜0.05)，p-p38和p-JNK的蛋白含量與0μmol/L RSG組相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖5。

討論

RA的本質是滑膜炎導致關節(jié)軟骨/骨破壞。在RA關節(jié)局部組織細胞和免疫細胞的相互作用下，滑膜炎增生的滑膜細胞(如FLS)釋放大量的炎癥介質如TNF-α、IL-1及IL-6等，趨化、募集單核/巨噬細胞至病變關節(jié)部位，同時形成局部的炎癥環(huán)境。FLS還可以大量分泌RANKL，與單核/巨噬細胞表面RANK結合，經(jīng)受體銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關因子6介導，激活多條激酶通路，誘導單核/巨噬細胞活化、增生并最終分化為Oc［7］。其中MARKs在Oc分化及活化中起重要作用，MAPKs(包括ERK、JNK和p38)是調控RA炎癥與骨破壞重要的信號通路［8］。抑制MAPKs可明顯降低佐劑關節(jié)炎大鼠及膠原誘導關節(jié)炎小鼠滑膜炎、骨及軟骨破壞［9］。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)RSG可抑制體外分離培養(yǎng)的RA-FLS表達RANKL，同時上調OPG表達，并且RA-FLS可通過高表達RANKL、低表達OPG誘導健康人外周血MNC分化為Oc［7，10］。本研究進一步模擬RA關節(jié)局部組織細胞與免疫細胞相互作用的微環(huán)境，將RA-FLS與健康人外周血MNC共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)RSG(15μmol/L)能明顯抑制RA-FLS誘導的MNC向Oc分化及骨吸收功能，提示PPARγ配體通過RANKL/OPG系統(tǒng)參與調控RA關節(jié)局部Oc分化及骨吸收功能，可能在RA骨破壞機制中起抑制作用。Cho等［11］報道RSG可抑制TNF-α、M-CSF及RANKL誘導的小鼠骨髓細胞向Oc分化及骨吸收功能。Yang等［12］也報道了RSG和吡格列酮可抑制TNF-α介導的RAW264.7細胞和小鼠骨髓細胞分化為Oc。然而，也有相反的報道。Wan等［13］發(fā)現(xiàn)RSG可促進RANKL及M-CSF誘導的小鼠骨髓細胞或脾細胞分化為Oc，從而促進骨吸收。Stunes等［14］發(fā)現(xiàn)吡格列酮處理4個月后的卵巢切除大鼠全身及股骨的骨密度及骨質量顯著低于未經(jīng)藥物處理的對照組卵巢切除大鼠。綜合上述不同代謝或免疫微環(huán)境中PPARγ活化對Oc分化及骨吸收功能的不同作用，我們認為免疫微環(huán)境對PPARγ調控Oc分化及骨吸收功能具有重要的影響，即在穩(wěn)態(tài)或非炎癥狀態(tài)的微環(huán)境下，PPARγ活化促進Oc形成，而在炎癥狀態(tài)下PPARγ活化通過抑制促Oc分化因子(如RANKL、TNF-α及IL-1等)表達從而抑制Oc分化及骨吸收功能。

Figure 4.The effectof rosiglitazone(RSG)on the protein expression of RANKL and OPG in RA-FLSandmonocyte coculture system.Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs0μmol/L RSG.圖4　RSG對共培養(yǎng)體系RANKL及OPG蛋白表達的影響

Figure 5.The effectof rosiglitazone(RSG)on the MAPK pathway in the RA-FLSandmonocyte coculture system.Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs0μmol/L RSG.圖5　RSG對共培養(yǎng)體系MAPK信號通路的影響

我們進一步的實驗結果顯示，在MAPKs信號通路中，RSG(15μmol/L)能明顯抑制RA-FLS與健康人外周血MNC共培養(yǎng)體系RANKL表達及p-ERK活化，而對p-p38及p-JNK無抑制作用，提示RSG可能通過抑制ERK磷酸化抑制RA-FLS誘導的Oc分化及功能。在MAPKs家族中，ERK主要通過影響下游c-Fos以及NFATc1的表達調控Oc的分化［15］。最新研究發(fā)現(xiàn)在Oc前體細胞(骨髓巨噬細胞)中ERK磷酸化可以促進微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅰ酯化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ結合到分泌性溶酶體小體上并促進溶酶體往細胞外釋放組織蛋白酶K，降解骨細胞外基質，破壞骨膠原［16］。結合本研究中RSG (15μmol/L)組RA-FLS誘導的Oc形成骨吸收陷窩面積較對照組明顯減少，提示在RA關節(jié)局部微環(huán)境中PPARγ激動劑可能主要通過ERK介導的信號通路調控Oc分化及骨吸收功能，這為RA關節(jié)破壞機制的研究提供了重要的實驗支持。

總之，我們的研究結果表明RSG可通過抑制RANKL及p-ERK活化抑制RA-FLS誘導的Oc分化及骨吸收功能，提示RSG可能通過影響RA關節(jié)微環(huán)境中組織細胞與免疫細胞相互作用從而抑制Oc分化及骨吸收功能，最終抑制RA骨破壞，為開發(fā)新的抑制RA關節(jié)骨破壞藥物提供了實驗證據(jù)。

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Rosiglitazone inhibits osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis by downregulating RANKL expression and suppressing ERK phosphorylation

WEIXiu-ning，ZHENG Dong-hui，MO Ying-qian，MA Jian-da，DAILie
(Department of Rheumatology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail:liedai2004@163.com)

R363.2;R593.22

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.025

1000-4718(2015)05-0911-06

2014-11-18［修回日期］2015-01-09

國家自然科學基金資助項目(No.81471597);高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No.20130171110075);廣東省自然科學基金資助項目(No.2014A030313074)

Tel:020-81332572;E-mail:liedai2004@163.com