慢病毒介導的GATA6基因沉默對肝癌Huh-7細胞凋亡的影響*

才錦麟，阿力亞，何強(中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州510080)

慢病毒介導的GATA6基因沉默對肝癌Huh-7細胞凋亡的影響*

才錦麟，阿力亞，何強△
(中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州510080)

目的:研究GATA6基因沉默對肝癌Huh-7細胞凋亡的影響，同時探討可能的作用機制。方法:構建靶向GATA6基因的慢病毒干擾載體，用流式細胞術確定轉染效率，用RT-PCR和Western blotting法檢測其對人類肝細胞癌細胞株Huh-7的干擾效果，流式細胞術檢測細胞凋亡比例，Western blotting法檢測各轉染組Huh-7細胞NF-κB及Bcl-2蛋白表達。結果:靶向GATA6基因的慢病毒干擾載體感染肝癌Huh-7細胞后，轉染效率為57.4%。GATA6在mRNA和蛋白水平的表達明顯下降。GATA6沉默的肝癌Huh-7細胞凋亡比例增加(P＜0.05)，NF-κB和Bcl-2蛋白水平表達降低。結論:利用慢病毒載體干擾技術沉默GATA6基因的表達可以明顯促進Huh-7細胞凋亡，其機制可能通過NF-κB信號通路調節凋亡相關蛋白的表達，進而影響細胞的凋亡。靶向GATA6的RNA干擾技術在肝癌的基因治療中具有一定的研究價值。

GATA6基因;慢病毒;RNA干擾;肝細胞癌

［ABSTRACT］AIM:To explore the effectof GATA6 gene silencing on apoptosis of hepatocellular carcinoma Huh-7 cells.METHODS:RNA interference vectors of the targetgene GATA6 mediated by lentiviruswere constructed in vitro to transfect the hepatocellular carcinoma cell line Huh-7.The apoptotic rate of transfected cellswasmeasured by flow cytometry.The protein expression of GATA6，NF-κB and Bcl-2 in transfected cells was determined by Western blotting.RESULTS:The transfection efficiency was 57.4%.ThemRNA and protein expression of GATA6 reduced significantly after the carcinoma cell line Huh-7 being transfected by RNA interference vectorsmediated by lentivirus.The apoptotic rate of the carcinoma cellswith silent GATA6 genewas significantly increased(P＜0.05).The protein expression levels of NF-κB and Bcl-2 were also significantly decreased.CONCLUSION:Lentiviral vector-mediated RNA interference of GATA6 has an inhibitory effecton the expression of the gene itself，and promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.Regulation of the apoptosis-related protein expression by the NF-κB signaling to influence the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cellsmight be one of the possiblemechanisms.

［KEY WORDS］GATA6 gene;Lentivirus;RNA interference;Hepatocellular carcinoma

人類GATA結合蛋白6(GATA binding protein 6，GATA6)基因定位于18q11.1-q11.2，其編碼蛋白GATA6含有2個特殊的蛋白質二級結構——鋅指結構。這2個鋅指結構域能結合特定的核苷酸序列(A/T)GATA(A/T)［1］。在正常的個體發育階段，GATA6可直接與心肌組織的肌鈣蛋白轉錄增強子結合，調節肌鈣蛋白的表達;同時聯系經典Wnt/β-catenin和非經典Wnt/JNK信號通路［2］，促進心肌組織成熟，在正常心血管系統和消化系統特異性分化與器官形成中發揮重要促進作用，是胚胎期發育中重要的調控基因［3］。

近年來，在膽管癌、卵巢癌等實體腫瘤中均發現GATA6的異常表達，且與腫瘤的分期和預后相關［4-5］。研究報道GATA6在結腸癌的發病及疾病進展中發揮關鍵作用［6］。GATA6表現出作為腫瘤治療靶點潛在的可能性。本文旨在探討沉默GATA6后對Huh-7細胞的抑制作用及可能的途徑，為臨床上治療肝癌提供新的思路。

材料和方法

1細胞株和菌株

本實驗采用人類肝細胞癌細胞株Huh-7(購自中山大學實驗動物中心)，用含10%胎牛血清的DMEM培養液，在37℃、5%CO2恒溫培養箱進行培養。慢病毒構建及包裝中使用的腎上皮293T細胞和大腸桿菌菌株DH5α，均購自上海吉凱基因化學有限公司。293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，在37℃、5%CO2恒溫培養箱進行培養。兔抗人GATA6多克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體和兔抗人Bcl-2單克隆抗體均為Santa Cruz產品。

2GATA6基因RNA干擾慢病毒載體制備及感染細胞

慢病毒載體質粒PGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉凱基因化學有限公司。實驗分3組:(1)隨機對照組(NC組);(2)空白對照組(control組);(3)實驗組(shGATA6組)。構建并合成shRNA干擾片段:正義鏈5’-GGGAAUUCAAACCAGGAAAUU-3’，反義鏈3’-UUCCCUUAAGUUUGGUCCUUU-5’，把合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 min，然后自然冷卻至室溫，形成帶黏性末端的雙鏈。將shRNA和PGCSIL-GFP進行酶切連接，制備和鑒定克隆后，以Qiagen公司的質粒抽提試劑盒提取慢病毒包裝系統中3種質粒DNA，用293T細胞進行病毒包裝。5 d后在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照，確定感染效率，流式細胞術定量。

3流式細胞術分析細胞凋亡率

收集各組細胞，PBS緩沖液洗滌，胰酶消化，調整細胞密度至5×108/L，加入500μL binding buffer懸浮細胞，分別加入10μL AnnexinV-FITC和10μL PI混勻，室溫避光孵育染色15 min，用FACS流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數，觀察凋亡細胞的百分比。

4RT-PCR法檢測GATA6 m RNA表達水平

轉染細胞至24 h時，每組各取6孔細胞，Trizol法提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄獲取cDNA，PCR儀擴增。GATA6上游引物5’-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3’，下游引物5’-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3’。內參照GAPDH上游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應條件:94℃5 min;40個循環，94℃45 s，57.5℃30 s，72℃10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像。

5Western blotting檢測

分別取接種在6孔板的對數生長期的慢病毒感染后的Huh-7細胞，用經過預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次。用濾紙吸凈PBS液后，每孔加入100μL RIPA裂解液+1μL PMSF。充分裂解后，用離心機于20 000×g、4℃下離心30min，上清液即為蛋白提取液。用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)測定樣品蛋白濃度。將樣品煮沸10 min變性。蛋白上樣量50 μg，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳轉移至NC膜，置于5%脫脂奶粉(TBST配制)中室溫封閉1 h。各轉染組分別加入GATA6抗體(1∶100)，NF-κB抗體(1∶500)，Bcl-2(1∶500)或GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃過夜。用TBST漂洗3次，每次10 min。加入HRP標記羊抗鼠Ⅱ抗或羊抗兔Ⅱ抗，室溫下于搖床孵育2 h。再次用TBST洗膜后，ECL發光法顯色，X線片曝光。

6統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P＜0.05為差異有統計學意義

結果

1肝細胞癌Huh-7細胞株中GATA6干擾慢病毒的感染效率

為了研究肝癌細胞中GATA6基因的作用，我們選用GATA6基因表達水平較高的Huh-7細胞進行GATA6基因沉默。Huh-7細胞鋪6孔板，24 h后加慢病毒感染。熒光顯微鏡下隨機選取視野，并對同一視野的細胞同時進行明視野和熒光視野的拍照，對比確定感染效率，利用流式細胞術定量檢測轉染效率為57.4%，見圖1。

Figure 1.Huh-7 cellswere infected with the GATA6-RNAi lentivirus for 96 h(×100).圖1　GATA6-RNAi慢病毒感染Huh-7細胞

2Western blotting和RT-PCR驗證GATA6沉默的效率

為了了解感染了慢病毒的肝癌Huh-7細胞內源性GATA6 mRNA和蛋白表達水平的改變，我們利用RT-PCR和Western blotting法對慢病毒感染的Huh-7細胞GATA6 mRNA和蛋白表達水平進行測定。結果發現慢病毒感染Huh-7細胞后能有效降低內源性GATA6 mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)水平，差異有統計學意義(P＜0.05)。

Figure 2.RT-PCR analysis of GATA6 mRNA levels(A)and Western blotting analysis of GATA6 protein levels(B)in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.圖2　GATA6 m RNA及蛋白在各組細胞中的表達

3慢病毒介導的GATA6沉默促進肝癌Huh-7細胞凋亡

慢病毒介導的GATA6沉默組的細胞凋亡率為(27.10±2.75)%，空白對照組和陰性對照組細胞凋亡率分別為(7.76±0.41)%和(7.70±0.45)%，實驗組細胞凋亡率較空白對照組和陰性對照組明顯升高(P＜0.05)，差異有統計學意義，見圖3。

Figure 3.Flow cytometry of cell apoptosis in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.圖3　流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況

4慢病毒介導GATA6沉默可能通過NF-κB和Bcl-2途徑促進Huh-7細胞凋亡

為了探討GATA6基因抑制凋亡的分子調控機制，慢病毒感染Huh-7細胞后，我們利用Western blotting法分析Huh-7細胞GATA6以及重要凋亡相關分子NF-κB和Bcl-2蛋白表達水平，以GAPDH蛋白作內參照。結果顯示，GATA6沉默后，與對照組比較，GATA6、NF-κB和Bcl-2蛋白表達量均明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.Western blotting analysis of NF-κB and Bcl-2 proteins in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.圖4　各組細胞NF-κB與BCL-2蛋白的表達

討論

NF-κB與基因啟動子區的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄功能，從而調節許多重要的生理過程，包括急性期炎癥免疫反應細胞的生長凋亡和腫瘤的形成。NF-κB通過上調許多抗凋亡相關蛋白，比如Bcl-2蛋白的表達而發揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用［7］。Colo等［8］研究發現在人類慢性粒細胞白血病K562細胞中GATA6敲除能引起NF-κB表達下調從而促進凋亡的發生。

在人類大多數腫瘤細胞中，GATA6的表達增高是常見的事件。GATA6在人類胰腺上皮內瘤變組織及胰腺癌組織中高表達，進一步研究表明GATA6的拷貝數量與胰腺癌患者的預后密切相關［9］。在本研究中，我們成功構建了抑制GATA6基因的慢病毒表達載體，并包裝成為病毒顆粒。再用病毒顆粒轉染肝癌Huh-7細胞，證實了轉染的效率，并發現Huh-7細胞中GATA6的表達下調。通過MTT實驗發現肝癌細胞生長明顯受到抑制，流式細胞術發現細胞凋亡比例增加。以上結果表明，下調GATA6的表達能夠明顯抑制細胞增殖，提高細胞凋亡。為了探討GATA6影響細胞凋亡的機制，我們從蛋白水平分析了凋亡相關蛋白的表達情況。Western blotting結果顯示NF-κB和Bcl-2蛋白水平明顯下降，以上結果表明:GATA6可能通過調控NF-κB和Bcl-2蛋白來影響細胞的凋亡過程。

90%以上的胰腺癌細胞，由于Wnt信號通路激活，提高了GATA6的表達，進而加速EGFR和AKT的磷酸化，導致NF-κB的表達增加以及活性增強。持續活化的NF-κB促進細胞生長、侵襲和轉移相關基因的持續表達，最終導致腫瘤的發生［10］。在部分結腸細胞中，抑癌因子microRNA-365表達受到抑制，從了促使了GATA6的激活，進一步促進了GPR49(G-protein coupled receptor 49)與NF-κB的活化，在結腸細胞的腫瘤化過程中起關鍵作用。GATA6作為一個促癌基因，當它的表達受到抑制時，進一步抑制NF-κB與Bcl-2的表達，導致細胞凋亡相關基因轉錄水平的下降，抑制了細胞的凋亡進程［4］。

在少數組織細胞中，GATA6表現為一個抑癌基因。研究表明，在人類惡性膠質瘤組織中，導致GATA6基因失效的關鍵突變，而正常人類腦膠質組織中未發現GATA6的突變。體外實驗中，沉默膠質細胞的GATA6基因，能夠增加VEGF表達，加速膠質細胞腫瘤化過程，GATA6表現出抑制腫瘤進展的作用［11］。

GATA6作為一個促癌基因，其機制被廣泛討論。GATA6特異的鋅指結構能與特異的G蛋白結合，促進尿激酶型纖溶酶原激活物的活化，提高了癌細胞的侵襲和轉移能力［12］。還有文獻報道，下調GATA6的表達，可以提高活性氧簇的生成，進而阻滯胰腺癌細胞的增殖［13］。在本研究中，我們發現GATA6基因在肝癌Huh-7細胞中起促癌作用，抑制肝癌Huh-7細胞凋亡的作用可能是促進NF-κB與Bcl-2的表達，以上結果為肝癌基因治療提供新的靶點。

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Effects of GATA6 silencing mediated by lentivirus on apoptosis of human liver cancer Huh-7 cells

CAIJin-lin，Aliya，HE Qiang
(Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:lheqiang@hotmail.com)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.030

1000-4718(2015)05-0938-05

2015-01-19［修回日期］2015-04-20

廣東省教育廳自然科學研究計劃項目(No.2009B030801175)

Tel:020-87755766;E-mail:lheqiang@hotmail.com