促紅細(xì)胞生成素對高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞纖維化的影響及其機制研究

柯本，吳險峰，陳艷霞，房向東

促紅細(xì)胞生成素對高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞纖維化的影響及其機制研究

柯本，吳險峰，陳艷霞，房向東

目的研究促紅細(xì)胞生成素(EPO)對高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞(MCs)增殖及其表達相關(guān)細(xì)胞因子和炎性因子的影響，探討EPO對腎臟組織的生物學(xué)效應(yīng)。方法2014年12月—2015年5月選取人MCs，采用隨機數(shù)字表法分為:空白對照組、高糖誘導(dǎo)組、甘露醇對照組、EPO對照組、5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)法檢測RhoA、鋅離子相關(guān)的RhoA蛋白1(ROCK1)mRNA表達水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測結(jié)締組織生長因子(CTGF)、Ⅳ型膠原蛋白、白介素6(IL－6)、腫瘤壞死因子α(TNF－α)表達水平;CCK－8法測定細(xì)胞增殖吸光度(OD值)。結(jié)果高糖誘導(dǎo)組較空白對照組RhoA、ROCK1mRNA表達水平升高(P＜0.05);5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組較高糖誘導(dǎo)組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平降低(P＜0.05);5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組RhoA、ROCK1mRNA表達水平組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Rho激酶抑制劑組較5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組RhoA mRNA表達水平升高，ROCK1 mRNA表達水平降低(P＜0.05)。高糖誘導(dǎo)組、5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組RhoA mRNA表達水平與ROCK1 mRNA表達水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.829、0.898、0.831、0.861，P＜0.05)。高糖誘導(dǎo)組較空白對照組培養(yǎng)24 h時CTGF及Ⅳ型膠原蛋白、培養(yǎng)24 h及48 h時IL－6及TNF－α表達水平升高(P＜0.05); 5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組培養(yǎng)24 h時CTGF及Ⅳ型膠原蛋白，培養(yǎng)24 h及48 h時IL－6及TNF－α表達水平較空白對照組升高，較高糖誘導(dǎo)組降低(P＜0.05);10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較5 U/m l EPO干預(yù)組培養(yǎng)24 h時CTGF及Ⅳ型膠原蛋白、培養(yǎng)24 h及48 h時IL－6及TNF－α表達水平降低(P＜0.05);20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較10 U/ml EPO干預(yù)組培養(yǎng)24 h時CTGF及Ⅳ型膠原蛋白、培養(yǎng)24 h及48 h時IL－6及TNF－α表達水平降低(P＜0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時，高糖誘導(dǎo)組、EPO對照組、5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組較空白對照組MCs增殖OD值升高，Rho激酶抑制劑組較空白對照組MCs增殖OD值降低(P＜0.05);5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組較高糖誘導(dǎo)組MCs增殖OD值升高，Rho激酶抑制劑組較高糖誘導(dǎo)組MCs增殖OD值降低(P＜0.05);5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組MCs增殖OD值組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);3組MCs增殖OD值培養(yǎng)24、48、72 h時兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論

促紅細(xì)胞生成素;糖尿病腎病;腎小球系膜細(xì)胞;纖維化;細(xì)胞增殖

柯本，吳險峰，陳艷霞，等.促紅細(xì)胞生成素對高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞纖維化的影響及其機制研究［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(30):3686－3691.［www.chinagp.net］

Ke B，Wu XF，Chen YX，et al.Effect of erythropoietin on high glucose－induced fibrosis of human kidney mesangial cells and its possible mechanism［J］．Chinese General Practice，2015，18(30):3686－3691.

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管嚴(yán)重病變的并發(fā)癥之一，最終導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)。腎臟細(xì)胞間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的累積是糖尿病導(dǎo)致腎小球纖維化的一個重要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)參與此過程，特別是白介素6(IL－6)與腫瘤壞死因子α(TNF－α)在DN的發(fā)病階段起著重要作用［1］。RhoA/鋅離子相關(guān)的RhoA蛋白(ROCK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是DN導(dǎo)致腎臟纖維化的重要通路之一，其可通過影響轉(zhuǎn)錄生長因子β(TGF－β)、血管緊張素Ⅱ、核因子(NF)－κB的分泌，激活并增強其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)腎臟纖維化［2］。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，能刺激紅系祖細(xì)胞的形成和分化。越來越多的證據(jù)顯示，EPO呈劑量依賴性的保護腎臟，防止腎臟纖維化［3］，但其機制仍不明了。本研究于2014年12月—2015年5月采用體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞(MCs)，檢測EPO對高糖誘導(dǎo)MCs的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑EPO(沈陽三生制藥股份有限公司)，高糖、甘露醇、ROCK抑制劑Y27632(美國Sigma公司)，DMEM 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青)，0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，RNA抽提試劑Trizol〔天根生化科技(北京)有限公司〕，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)試劑盒(日本Takara)，2×Easy Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，CCK－8試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)，結(jié)締組織生長因子(CTGF)、Ⅳ型膠原蛋白、IL－6及TNF－α檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)。

1.2 主要儀器核酸微量蛋白測定儀、PCR擴增儀、凝膠圖像成像系統(tǒng)(美國Bio－Rad)，DYPC－31DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.3 MCs培養(yǎng)及實驗分組MCs來源于美國菌種保藏中心(ATCC)細(xì)胞庫。用含10%FBS的DMEM 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至70%～80%融合時用胰蛋白酶－乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(含0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA)消化傳代。采用隨機數(shù)字表法將MCs分為:空白對照組、高糖誘導(dǎo)組、甘露醇對照組、EPO對照組、5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組。

1.4 方法

1.4.1 RT－PCR法檢測RhoA、ROCK1 mRNA表達水平

用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA(RNA simple總RNA提取試劑盒)。按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以人β－actin為內(nèi)參照。引物序列根據(jù)國際互聯(lián)網(wǎng)cDNA文庫檢索的原始序列設(shè)計，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。RhoA引物序列:上游引物5'－GGCTGGACTCGGATTCGTTG－3'，下游引物5'－CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC－3'，擴增產(chǎn)物356 bp。ROCK1引物序列:上游引物5'－TGATGGCTATTATGGA CGAG－3'，下游引物5'－GGAGCGTTTCCCAAGC－3'，擴增產(chǎn)物293 bp。β－actin引物序列:上游引物5'－CGGGAAATCGTGCGTGAC－3'，下游引物5'－TGGAAGGTGGACAGCGAGG－3'，擴增產(chǎn)物434 bp。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，60℃退火30 s，72℃延伸7 min，共32個循環(huán)。取PCR擴增產(chǎn)物10μl于2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析儀觀察。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測炎性因子表達水平收集細(xì)胞上清液，按各ELISA試劑盒說明書進行操作，于酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品CTGF、Ⅳ型膠原蛋白、IL－6及TNF－α表達水平。培養(yǎng)24 h時，檢測CTGF與Ⅳ型膠原蛋白表達水平，CTGF與Ⅳ型膠原蛋白用來證明EPO對于改善腎臟纖維化有作用，檢測1次;培養(yǎng)24、48 h時，檢測IL－6、TNF－α表達水平，連續(xù)觀察相關(guān)炎性因子的改變。

1.4.3 CCK－8法檢測細(xì)胞增殖將1×105個/m l細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液200μl，細(xì)胞生長至70%～80%融合狀態(tài)時換無血清DMEM 1640培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24 h，然后分別加入不同濃度的刺激藥物:空白對照組(無血清DMEM 1640培養(yǎng)基)、高糖誘導(dǎo)組(30 mmol/L葡萄糖)、甘露醇對照組(24.5 mmol/L甘露醇)、EPO對照組(20 U/ml EPO)、5 U/ml EPO干預(yù)組(5 U/m l EPO+30 mmol/L葡萄糖)、10 U/ml EPO干預(yù)組(10 U/ml EPO+30 mmol/L葡萄糖)、20 U/ml EPO干預(yù)組(20 U/ml EPO+30 mmol/L葡萄糖)、Rho激酶抑制劑組(10 nmol/L Y27632+30 mmol/L葡萄糖)，各組其他成分與空白對照組相同，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組設(shè)6個復(fù)孔。按CCK－8試劑盒說明書檢測MCs增殖，于酶標(biāo)儀450 nm處測OD值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平比較各組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中，高糖誘導(dǎo)組較空白對照組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組較高糖誘導(dǎo)組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Rho激酶抑制劑組較5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組RhoA mRNA表達水平升高，ROCK1 mRNA表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1、圖1)。

表1 各組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平比較(±s，n=3)Table 1 Comparison of the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 among different groups

表1 各組RhoA、ROCK1 mRNA表達水平比較(±s，n=3)Table 1 Comparison of the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 among different groups

注:EPO=促紅細(xì)胞生成素，ROCK1=鋅離子相關(guān)的RhoA蛋白1;與空白對照組比較，aP＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，bP＜0.05;與5 U/ml EPO干預(yù)組比較，cP＜0.05;與10 U/ml EPO干預(yù)組比較，dP＜0.05;與20 U/m l EPO干預(yù)組比較，eP＜0.05

組別0.644±0.005 0.448±0.012高糖誘導(dǎo)組1.562±0.018a0.870±0.014a甘露醇對照組0.644±0.005 0.444±0.010 EPO對照組0.640±0.015 0.442±0.011 5 U/ml EPO干預(yù)組1.164±0.011ab0.674±0.007ab10 U/ml EPO干預(yù)組0.769±0.013abc0.620±0.014abc20 U/ml EPO干預(yù)組0.217±0.023abcd0.417±0.010abcdRho激酶抑制劑組1.437±0.023cde0.192±0.013cdeF RhoA mRNA ROCK1mRNA空白對照組值＜0.001＜0.001 2 745.301 877.137 P值

圖1 各組RhoA、ROCK1 mRNA表達情況Figure 1 mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 amon different groups

2.2 RhoA mRNA表達水平與ROCK1 mRNA表達水平相關(guān)性分析高糖誘導(dǎo)組、5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組RhoA mRNA表達水平與ROCK1 mRNA表達水平均呈正相關(guān)(r值分別為0.829、0.898、0.831、0.861，P＜0.05)。

2.3 各組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平比較培養(yǎng)24 h時，各組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中，高糖誘導(dǎo)組較空白對照組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較空白對照組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平升高，較高糖誘導(dǎo)組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較5 U/ml EPO干預(yù)組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較10 U/ml EPO干預(yù)組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

表2 各組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平比較(±s，ng/ml，n=3)Table 2 Comparison of the expression levels of CTGF and collagenⅣamong different groups

表2 各組CTGF、Ⅳ型膠原蛋白表達水平比較(±s，ng/ml，n=3)Table 2 Comparison of the expression levels of CTGF and collagenⅣamong different groups

注:CTGF=結(jié)締組織生長因子;與空白對照組比較，aP＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，bP＜0.05;與5 U/ml EPO干預(yù)組比較，cP＜0.05;與10 U/m l EPO干預(yù)組比較，dP＜0.05

組別CTGFⅣ型膠原蛋白空白對照組88.0±1.7 989±11高糖誘導(dǎo)組224.0±4.2a2 852±49a甘露醇對照組87.6±1.2 988±13 EPO對照組87.9±1.0 990±13 5 U/m l EPO干預(yù)組203.7±3.1ab2 382±15ab10 U/ml EPO干預(yù)組145.1±1.2abc1 867±37abc20 U/ml EPO干預(yù)組120.9±2.2abcd1 281±19abcdRho激酶抑制劑組103.4±2.1abcd1 079±13abcdF 值＜0.001＜0.001 1 624.974 2 899.094 P值

2.4 各組IL－6及TNF－α表達水平比較培養(yǎng)24、48 h時，各組IL－6、TNF－α表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中，高糖誘導(dǎo)組較空白對照組IL－6、TNF－α表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較空白對照組IL－6、TNF－α表達水平升高，較高糖誘導(dǎo)組IL－6、TNF－α表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較5 U/m l EPO干預(yù)組IL－6、TNF－α表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);20 U/ml EPO干預(yù)組、Rho激酶抑制劑組較10 U/ml EPO干預(yù)組IL－6、TNF－α表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表3、4)。

表3 各組培養(yǎng)24、48 h時IL－6表達水平比較±s，ng/ml，n=3)Table 3 Comparison of the expression levelof IL－6 among differentgroups at24 h and 48 h

表3 各組培養(yǎng)24、48 h時IL－6表達水平比較±s，ng/ml，n=3)Table 3 Comparison of the expression levelof IL－6 among differentgroups at24 h and 48 h

注:與空白對照組比較，aP＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，bP＜0.05;與5 U/m l EPO干預(yù)組比較，cP＜0.05;與10 U/ml EPO干預(yù)組比較，dP＜0.05

組別5.16±0.11 5.43±0.39高糖誘導(dǎo)組18.78±0.17a19.77±1.23a甘露醇對照組5.20±0.12 5.56±0.16 EPO對照組5.13±0.27 5.34±0.228 5 U/ml EPO干預(yù)組14.76±0.59ab14.36±0.73ab10 U/ml EPO干預(yù)組11.70±0.55abc10.84±0.56abc20 U/ml EPO干預(yù)組8.40±0.50abcd8.35±0.48abcdRho激酶抑制劑組6.84±0.59abcd6.75±0.03abcdF 24 h 48 h空白對照組值＜0.001＜0.001 453.174 229.059 P值

表4 各組培養(yǎng)24、48 h時TNF－α表達水平比較±s，ng/m l，n =3)Table 4 Comparison of the expression level of TNF－αamong different groups at24 h and 48 h

表4 各組培養(yǎng)24、48 h時TNF－α表達水平比較±s，ng/m l，n =3)Table 4 Comparison of the expression level of TNF－αamong different groups at24 h and 48 h

注:與空白對照組比較，aP＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，bP＜0.05;與5 U/m l EPO干預(yù)組比較，cP＜0.05;與10 U/ml EPO干預(yù)組比較，dP＜0.05

組別5.55±0.44 6.25±0.12高糖誘導(dǎo)組15.53±0.44a16.56±0.54a甘露醇對照組5.67±0.36 6.17±0.08 EPO對照組5.43±0.43 6.20±0.23 5 U/ml EPO干預(yù)組14.56±0.48ab12.52±0.41ab10 U/ml EPO干預(yù)組11.40±0.38abc11.24±0.13abc20 U/ml EPO干預(yù)組9.40±0.42abcd8.86±0.24abcdRho激酶抑制劑組7.66±0.31abcd7.26±0.11abcdF 24 h 48 h空白對照組值＜0.001＜0.001 293.319 556.221 P值

2.5 各組MCs增殖OD值培養(yǎng)24、48、72 h時，各組MCs增殖OD值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其中，高糖誘導(dǎo)組、EPO對照組、5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組較空白對照組MCs增殖OD值升高，Rho激酶抑制劑組較空白對照組MCs增殖OD值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/ml EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組較高糖誘導(dǎo)組MCs增殖OD值升高，Rho激酶抑制劑組較高糖誘導(dǎo)組MCs增殖OD值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/m l EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/ml EPO干預(yù)組MCs增殖OD值組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);5 U/ml EPO干預(yù)組、10 U/m l EPO干預(yù)組、20 U/m l EPO干預(yù)組MCs增殖OD值培養(yǎng)24、48、72 h時兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表5)。

表5 各組培養(yǎng)24、48、72 h時MCs增殖OD值比較(±s，n=3)Table 5 Comparison of the OD value of MCs proliferation among different groups at24 h，48 h and 72 h

表5 各組培養(yǎng)24、48、72 h時MCs增殖OD值比較(±s，n=3)Table 5 Comparison of the OD value of MCs proliferation among different groups at24 h，48 h and 72 h

注:與空白對照組比較，aP＜0.05;與高糖誘導(dǎo)組比較，bP＜0.05;與5 U/ml EPO干預(yù)組比較，cP＜0.05;與10 U/ml EPO干預(yù)組比較，dP＜0.05;與同組培養(yǎng)24 h時比較，eP＜0.05;與同組培養(yǎng)48 h時比較，fP＜0.05

組別24 h 48 h 72 h空白對照組0.193±0.004 0.225±0.007 0.263±0.011高糖誘導(dǎo)組0.332±0.014a0.418±0.008a0.624±0.017a甘露醇對照組0.194±0.004 0.227±0.007 0.263±0.012 EPO對照組0.277±0.010a0.363±0.006a0.518±0.017a5 U/ml EPO干預(yù)組0.627±0.009ab0.823±0.004abe1.208±0.016abef10 U/ml EPO干預(yù)組0.736±0.007abc0.984±0.011abce1.469±0.012abcef20U/ml EPO干預(yù)組0.964±0.006abcd1.377±0.085abcde1.830±0.014abcdefRho激酶抑制劑組0.154±0.007ab0.167±0.004ab0.196±0.016abF值3 577.891 600.581 5 501.656 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

EPO是一種分子量為30.4 kDa的糖蛋白，在成年人中主要由腎皮質(zhì)的腎小管周圍成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。EPO常在機體低氧狀態(tài)下生成，并在骨髓中通過紅細(xì)胞生成素受體介導(dǎo)的信號途徑控制著紅細(xì)胞的生成［4］。近年來，EPO在腎臟纖維化中的作用被廣泛關(guān)注［5］。有研究報道，內(nèi)源性EPO與DN的炎性反應(yīng)及死亡有關(guān)［6］，EPO可通過下調(diào)RhoA、ROCK1及ROCK2的表達水平［7］，減少CTGF及Ⅳ型膠原蛋白的分泌，減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生［2，8］，緩解DN的發(fā)展。本研究亦發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EPO作用于高糖培養(yǎng)的MCs時，可減少細(xì)胞炎性因子的分泌，且隨著EPO濃度的增加，細(xì)胞炎性因子分泌量顯著減少，說明EPO可通過抑制相關(guān)細(xì)胞因子及炎性因子的分泌達到保護腎臟的作用，從而抑制由高糖介導(dǎo)的腎小球纖維化。且在本實驗中，將ROCK抑制劑Y27632作用于高糖培養(yǎng)的MCs后，較高糖誘導(dǎo)組，細(xì)胞凋亡減少，且各種細(xì)胞因子及炎性因子分泌顯著減少。這意味著在DN的發(fā)病過程中，高糖可通過激活RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致腎臟纖維化，而EPO保護腎臟，抑制腎臟纖維化的機制可能與阻滯RhoA /ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

慢性炎癥是慢性腎臟病(CKD)的顯著特點之一，IL－6和TNF－α是慢性炎癥的標(biāo)志物。研究報道，IL－6和TNF－α可通過阻滯EPO介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，加重腎損害［9］。同時，另有研究報道，CKD患者對EPO反應(yīng)性的降低是CKD發(fā)展的真正原因，而炎性因子均能不同程度地降低機體對EPO的反應(yīng)性［10］。反過來，內(nèi)源性EPO是機體炎性因子的獨立預(yù)測因子，其通過減少炎性因子的分泌保護腎臟［6］。而關(guān)于EPO如何減少炎性因子表達的具體機制仍不明了。

高血糖是DN發(fā)展的基礎(chǔ)因素之一［11］，其機制可能與高血糖導(dǎo)致MCs凋亡增加及減少細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)［12］。最近，Loeffler等［13］用EPO治療DN小鼠模型后觀察到，經(jīng)短期治療后的DN小鼠模型腎臟重量下降，且評估腎功能的各指標(biāo)均有所下降。這提示EPO在DN發(fā)展中起保護腎臟的作用，其機制可能與EPO減輕腎臟炎性反應(yīng)及抑制MCs凋亡有關(guān)。Johnson等［14］也證實，EPO在急性腎損傷的動物模型中起到了積極保護腎臟的作用。Dang等［15］認(rèn)為，EPO在腎小管細(xì)胞中能減少由高糖引起的氧化應(yīng)激，從而抑制高糖介導(dǎo)的腎小管細(xì)胞凋亡，保護腎臟。然而，Lim等［11］卻發(fā)現(xiàn)，高糖在小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中通過激活EPO受體具有促進EPO mRNA及EPO表達的作用。因此，高糖在DN早期能刺激EPO分泌來保護腎臟。總之，EPO可通過多種途徑保護腎臟，其中RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是其緩解腎損傷的重要途徑之一。

本實驗旨在探討EPO延緩DN發(fā)展的可能機制，課題仍存在不足之處。Y27632作為Rho激酶抑制劑，其特異性尚存在不足。研究報道，Y27632亦可通過阻斷蛋白激酶C相關(guān)激酶2，進而抑制相關(guān)RNA的表達來調(diào)節(jié)機體炎癥狀態(tài)［16］。此外，本研究并未就EPO在RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的具體作用做深入研究。

綜上所述，EPO具有保護腎臟的作用，其可通過抑制RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少高糖誘導(dǎo)的MCs CTGF及Ⅳ型膠原蛋白的分泌，減少炎性因子IL－6及TNF－α的產(chǎn)生，保護腎臟，延緩腎間質(zhì)纖維化。因此，EPO參與了DN腎臟病變過程，這對于重組人EPO的臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。

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Effect of Erythropoietin on High Glucose－induced Fibrosis of Hum an Kidney Mesangial Cells and Its Possible Mechanism

KE Ben，WU Xian－feng，CHEN Yan－xia，et al.Department of Nephrology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

Objective To explore the effect of rythropoietin(EPO)on the proliferation of high glucose－cultured human kidney mesangial cells(MCs)and its expression levels of cytokines and inflammatory factors and investigate the biological effects of EPO on renal tissue.Methods From December 2014 to May 2015，obtained MCs and employed random number table method to divide them into eight groups:blank control group，high glucose induction group，mannitol control group，EPO control group，5 U/m l EPO intervention group，10 U/m l EPO intervention group，20 U/m l EPO intervention group and Rho kinase inhibitor group.The mRNA levels of RhoA and ROCK1 were determined by RT－PCR;connective tissue growth factor (CTGF)，Collagen Ⅳ、Interleukin－6(IL－6)and tumor necrosis factor－α(TNF－α)were detected by ELISA; absorbance value(OD value)of cell proliferation was measured by CCK－8.Results High glucose induction group was higher (P＜0.05)than blank control group in the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1;5 U/m l EPO intervention group，10 U/ml EPO intervention group and 20 U/ml EPO intervention group were lower(P＜0.05)than glucose induction group in the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1;the pairwise comparison among 5 U/m l EPO intervention group，10 U/ml EPO intervention group and 20 U/m l EPO intervention group showed significant differences(P＜0.05)in them RNA expression levels of RhoA and ROCK1;Rho kinase inhibitor group was higher(P＜0.05)than 5 U/m l EPO intervention group，10 U/m l EPO intervention group and 20 U/m l EPO intervention group in the mRNA expression levels of RhoA and lower in the mRNA expression levels of ROCK1.The mRNA expression level of RhoA was positively correlated with that of ROCK1 in high glucose induction group，5 U/m l EPO intervention group，10 U/m l EPO intervention group and 20 U/m l EPO intervention group(r =0.829，0.898，0.831，0.861;P＜0.05).High glucose group was higher(P＜0.05)than blank control group in the levels of CTGF and Collagen Ⅳ at 24 h and the levels of IL－6 and TNF－αat24 h and 48 h;5 U/m l EPO intervention group，10 U/m l EPO intervention group，20 U/m l EPO intervention group and Rho kinase inhibitor group were higher(P＜0.05)than blank control group and were lower than high glucose induction group in the levels of CTGF and Collagen Ⅳ at24 h and the levels of IL－6 and TNF－αat 24 h and 48 h;10 U/m l EPO intervention group，20 U/m l EPO intervention group and Rho kinase inhibitor group were lower(P＜0.05)than 5 U/m l EPO intervention group in the levels of CTGF and Collagen Ⅳ at24 h and the levels of IL－6 and TNF－αat24 h and 48 h;20 U/m l EPO intervention group and Rho kinase inhibitor group were lower(P＜0.05)than 10 U/m l EPO intervention group in the levels of CTGF and Collagen Ⅳ at24 h and the levels of IL－6 and TNF－α at24 h and 48 h.At24 h，48 h and 72 h，high glucose induction group，EPO control group，5 U/m l EPO intervention group，10 U/m l EPO intervention group and 20 U/m l EPO intervention group were higher(P＜0.05)than blank control group in the OD value of MCs proliferation，and Rho kinase inhibitor group was lower(P＜0.05)than high glucose induction group in the OD value of MCs proliferation;the pairwise comparison among 5 U/m l EPO intervention group，10 U/ml EPO intervention group and 20 U/m l EPO intervention group showed significant differences in the OD value of MCs proliferation(P＜0.05);in each of the three groups，the pairwise comparison of OD value of MCs proliferation among24 h，48 h and 72 h showed significant differences (P＜0.05).Conclusion High glucose can inhibit the proliferation of MCs;high glucose can increase the expression of CTGF，Collagen Ⅳ，IL－6 and TNF－α，and EPO can inhibit the expression of CTGF，Collagen Ⅳ，IL－6 and TNF－αin MCs cultured by high glucose in certain concentration range and time range，facilitate proliferation and protect kidney.The mechanism may be related with the signal transduction pathway of RhoA/ROCK.

Erythropoietin;Diabetic nephropathies;Mesangial cells;Fibrosis;Cell proliferation

R 587.24

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.30.012

2015－06－15;

2015－09－14)

(本文編輯:陳素芳)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81460142)

330006江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

房向東，330006江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科;E－mail:xiangdongfang818@sina.com

高糖可抑制人MCs增殖;高糖可促進人MCs的CTGF、Ⅳ型膠原蛋白和IL－6、TNF－α的表達，而EPO在一定濃度和時間范圍內(nèi)可抑制高糖誘導(dǎo)MCs的CTGF、Ⅳ型膠原蛋白和IL－6、TNF－α的表達，促進增殖，保護腎臟，其機制可能與RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。