更年期高血壓燥證大鼠模型的構建

葛麗，林雪，李鴻霞

更年期高血壓燥證大鼠模型的構建

葛麗，林雪，李鴻霞

目的探索更年期高血壓燥證大鼠模型的建立方法。方法2014年1—3月選取雌性自發性高血壓大鼠(SHR)12只，采用摸球法將SHR隨機分為更年期高血壓組和更年期高血壓燥證造模組，每組6只。采用外科手術法摘除兩組大鼠雙側卵巢，制備更年期高血壓大鼠。對更年期高血壓燥證造模組大鼠施加人工燥證環境，飼喂西北燥證食物進行造模。觀察大鼠生物學特征(毛色、精神狀態、興奮度、進食量、飲水量、體質量、大小便性狀、舌象、爪象等)、血清神經遞質〔促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5－羥色胺(5－HT)〕及激素〔雌二醇(E2)、睪酮(T)〕水平和臟器(肝臟、脾臟、腎上腺、下丘腦)組織結構。結果更年期高血壓燥證造模組大鼠較更年期高血壓組體質量降低，飲水量增加，尿量減少(P＜0.05)。更年期高血壓燥證造模組大鼠血清CRH、NE、DA、5－HT水平較更年期高血壓組升高(P＜0.05)。兩組大鼠ACTH水平比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。更年期高血壓燥證造模組大鼠較更年期高血壓組血清E2、T水平降低，E2/T升高(P＜0.05)。兩組大鼠肝臟、脾臟、腎上腺、下丘腦組織結構均發生明顯改變。結論通過對更年期高血壓大鼠施加人工燥證環境，給予西北燥證食物，控制飲水量及進食量，可成功建立更年期高血壓燥證大鼠模型。

高血壓;更年期;燥證;模型，動物

葛麗，林雪，李鴻霞.更年期高血壓燥證大鼠模型的構建［J］．中國全科醫學，2015，18(30):3692－3696.［www.chinagp.net］

Ge L，Lin X，Li HX.Establishment of climacteric hypertension dryness syndrome model in rats［J］．Chinese General Practice，2015，18(30):3692－3696.

近年來國內外對于高血壓的動物實驗研究日漸加深，研究成果日益顯著，但針對更年期高血壓的動物實驗研究匱乏。隨著中醫藥地不斷發展，中醫病證結合動物模型的研究日益受到關注。李鴻霞［1］、甘慶雷［2］研究結果顯示，采用去勢方法摘除自發性高血壓大鼠(SHR)的卵巢，可以建立更年期高血壓大鼠模型，為進一步研究更年期高血壓病證結合動物模型打下基礎。因受環境因素的影響，不同地區的發病狀態不同，特定地域存在著特發或高發疾病［3］。新疆地處西北，降水稀少，是典型的干旱地區［4］。此處居民機體會出現一系列諸如干澀、焦慮、煩躁等異常反應。干燥環境下生活的人們，機體必然會由于受到這種環境的影響而產生相應的病理生理變化。西北地區常見的臨床癥狀，如口鼻干燥、煩躁等，既能影響新疆高發疾病(如高血壓、糖尿病等)的發病和病變過程，又是這些疾病的誘因和臨床癥狀表現之一［5］。在動物模型研究中，依據中醫理論，以病因模擬為切入點，觀察生物學特征，遵循證候演變規律復制的病因型動物模型，能保持與臨床證候特征的一致性，反映中醫證候的實質，是比病理型動物模型更加接近中醫證候的實驗動物模型［6－7］。有研究顯示，建立病證結合西北燥證動物模型要考慮動物年齡、性別及實驗季節、氣候、環境等相關因素，優化造模因素，選用多因素造模，可以通過病因、癥狀相對指標和絕對指標反映生物特征［8］。本研究旨在通過建立更年期高血壓燥證大鼠模型，為進一步開展更年期高血壓動物實驗提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2014年1—3月選取雌性SHR 12只，無特定病原體(SPF級)，11月齡，體質量(200.0 ±30.0)g，均由北京維通利華實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(京)2011－0008。

1.2 儀器與試劑儀器:RQH－250型人工氣候箱(上海精宏實驗設備有限公司)，HI1220烤片機、HI1210攤片機、RM2245切片機、Leica DM6000B光學顯微鏡、光學顯微照相系統(德國Leica公司)。

試劑:4%多聚甲醛溶液、25%戊二醛溶液〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，石蠟(Paraffin Wax美國SigmA－Aldrich公司)，蘇木素、伊紅(北京索萊寶科技有限公司)，大鼠促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5－羥色胺(5－HT)、雌二醇(E2)、睪酮(T)ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 實驗分組采用摸球法將SHR隨機分為更年期高血壓組和更年期高血壓燥證造模組，每組6只。

1.4 研究方法所有大鼠采用分籠飼養，每籠6只，室溫下〔溫度(25±3)℃，相對濕度40.0%～60.0%〕6:00～18:00提供光線，給予普通大鼠飼料喂養，自由攝食、飲水。采用外科手術法摘除兩組大鼠雙側卵巢，制備成更年期高血壓大鼠。更年期高血壓燥證造模組大鼠術后1周，每日給予西北燥證特殊飼料(普通大鼠飼料+0.5%孜然+0.5%五香粉+10%動物脂肪+2.5%油炸花生仁+2.5%熟芝麻)100 g，飲用水200 ml，每天10:00放入RQH－250型人工氣候箱中，系統溫度設定為室溫(25±3)℃，相對濕度25.0%～32.8%，20:00取出。造模時長共21 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 生物學特征主要對各組大鼠毛色、精神狀態、興奮度、進食量、飲水量、體質量、大小便性狀、舌象、爪象等進行觀察。

1.5.2 血清指標檢測造模結束后，將兩組大鼠處死采血收集血清，用ELISA法測定大鼠血清神經遞質(CRH、ACTH、NE、DA、5－HT)及激素(E2、T)水平。

1.5.3 臟器組織結構造模結束，將兩組大鼠處死后，于每只大鼠相同部位迅速取出肝臟、脾臟、腎上腺、下丘腦組織各5 mm×5 mm×4 mm，每個臟器組織取2份樣本，分別置于4%多聚甲醛溶液及25%戊二醛溶液中固定，按組別進行標記。

1.5.3.1包埋切片將已脫水處理過的組織樣本用一次性包埋盒、石蠟包埋組織塊，待石蠟冷卻后修塊，用RM2245切片機對樣本組織包埋蠟塊進行切片，厚度0.4μm。將切下的組織蠟片使用HI1210攤片機攤片后撈片，然后放入HI1220烤片機進行烤片，烤干后切片。1.5.3.2 HE染色將切好的組織切片放入HI1220烤片機中烤片1 h后進行脫蠟、水洗后，浸入蘇木素及伊紅中染色，晾干切片，用中性樹膠封固，制好的切片于Leica DM6000B光學顯微鏡(×100倍、×200倍、×400倍)下觀察，并使用光學顯微照相系統進行攝片。1.6統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料以(±s)表示，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物學特征更年期高血壓組大鼠毛色正常、少澤，精神狀態興奮、喜動、反應靈敏，進食量及飲水量正常，體質量增長不明顯，小便色黃，大便顆粒狀偏干，舌紅，爪甲紅無澤。更年期高血壓燥證造模組大鼠毛黃干枯、少澤，性情煩躁、易怒、好斗，進食量減少，飲水量增加，體質量減輕，小便短赤，大便干結而少，舌暗紅少苔，爪枯干燥多皮。

更年期高血壓燥證造模組大鼠較更年期高血壓組體質量降低，飲水量增加，尿量減少，差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

表1 兩組大鼠體質量、飲水量及尿量比較(±s)Table 1 Comparison of body mass，water intake and urine volume of rats between two groups

表1 兩組大鼠體質量、飲水量及尿量比較(±s)Table 1 Comparison of body mass，water intake and urine volume of rats between two groups

組別只數體質量(g)飲水量(ml)尿量(ml) 6 212.5±12.6 17.1±5.9 4.29±1.47更年期高血壓燥證造模組6 182.2±13.1 87.3±9.3 2.67±0.23 t更年期高血壓組4.076 15.609 2.667 P值值0.002＜0.001 0.045

2.2 血清神經遞質水平更年期高血壓燥證造模組大鼠血清CRH、NE、DA、5－HT水平較更年期高血壓組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。兩組大鼠ACTH水平比較，差異無統計學意義(P＞0.05，見表2)。

表2 兩組大鼠血清神經遞質水平比較(±s，ng/L)Table 2 Comparison of serum levels of neurotransmitters of rats between two groups

表2 兩組大鼠血清神經遞質水平比較(±s，ng/L)Table 2 Comparison of serum levels of neurotransmitters of rats between two groups

注:CRH=促腎上腺皮質激素釋放激素，ACTH=促腎上腺皮質激素，NE=去甲腎上腺素，DA=多巴胺，5－HT=5－羥色胺

組別只數±10.2更年期高血壓燥證造模組6 49.9±11.2 43.4±13.7 66.5±17.9 70.8±15.5 65.2±14.2 t值CRH ACTH NE DA 5－HT更年期高血壓組6 34.2±4.1 31.1±8.3 43.9±12.2 35.8±11.4 47.4 0.023 0.089 0.002 0.001 0.032 3.224 1.887 3.421 4.445 2.496 P值

2.3 血清激素水平更年期高血壓燥證造模組大鼠較更年期高血壓組血清E2、T水平降低，E2/T升高，差異有統計學意義(P＜0.05，見表3)。

表3 兩組大鼠血清激素水平比較±s)Table3 Comparison of serum levels of hormones of rats between two groups

表3 兩組大鼠血清激素水平比較±s)Table3 Comparison of serum levels of hormones of rats between two groups

注:E2=雌二醇，T=睪酮

組別只數E2(pg/ml)T(mmol/ml)E2/T更年期高血壓組6 27.5±5.6 6.1±0.5 4.8±0.4更年期高血壓燥證造模組6 11.1±4.3 1.5±0.4 8.4±0.4 t值5.695 16.282 17.033 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 臟器組織結構HE染色結果顯示，更年期高血壓組肝臟:肝小葉結構正常，肝竇輕度充血擴張，肝細胞輕度增生，可見雙核及核分裂，肝細胞輕度脂肪變性，枯否細胞輕度增生，間質少量淋巴細胞浸潤;脾臟:白髓輕度增生，脾竇輕度充血擴張，脾小體中央動脈輕度玻璃樣變;腎上腺:腎上腺結構不清，束狀帶排列紊亂，細胞膜不清晰，細胞質內含豐富類脂質，部分區域細胞壞死崩解，血竇充血擴張，部分區域見出血及含鐵血黃素沉著;下丘腦:腦組織輕度充血水腫，膠質細胞輕度增生，少量淋巴細胞浸潤(見圖1)。

更年期高血壓燥證造模組肝臟:肝小葉結構正常，排列整齊，中央靜脈及肝竇輕度充血擴張，肝細胞中度增生，可見雙核及核分裂，肝細胞中度脂肪變性，枯否細胞輕度增生，間質少量淋巴細胞浸潤;脾臟:脾結構正常，白髓輕度增生，脾竇輕度充血擴張，脾小體中央動脈玻璃樣變;腎上腺:腎上腺結構不清，束狀帶排列紊亂，細胞膜不清晰，細胞質內含豐富類脂質，部分區域細胞壞死崩解，血竇充血擴張，部分區域見出血及含鐵血黃素沉著，程度較更年期高血壓組大鼠重;下丘腦:腦組織輕度充血水腫，膠質細胞明顯增生，少量淋巴細胞浸潤(見圖2)。

圖1 更年期高血壓組大鼠臟器組織結構(HE染色，×400)Figure 1 The histological changesof organs among rats in climacteric hypertension grou p

圖2 更年期高血壓燥證造模組大鼠臟器組織結構(HE染色，×400)Figure 2 The histological changes of organs among rats in climacteric hypertension dryness syndromemodel group

3 討論

本研究通過對更年期高血壓大鼠施加人工燥證環境，給予西北燥證食物，控制飲水量及進食量以建立更年期高血壓燥證大鼠模型，結果顯示，更年期高血壓燥證造模組大鼠生物學特征表現為毛黃干枯、少澤，性情煩躁、易怒、好斗，進食量減少，飲水量增加，小便短赤，大便干結而少，舌暗紅少苔，爪枯干燥多皮等一系列明顯的燥證癥狀，依據“從外知內”的中醫辨證論治思想，可以推測造模大鼠機體內部臟腑可能有燥證病理變化，因而顯示出一系列內、外燥證的諸多癥狀。本研究大鼠血清標志物檢測顯示，與更年期高血壓大鼠比較，更年期高血壓燥證造模大鼠血清CRH、NE、DA、5－HT水平均升高。這一結果說明，由于CRH、NE、DA水平的升高，降低了腦干網狀結構的閾值，使其興奮性增高，腦干網狀結構的上行激動系統興奮，導致大腦皮質廣泛持續興奮，引起焦躁不安，環境中“應激源”的出現，會促使NE等分泌進一步急劇上升，則極易發生暴力行為。有研究顯示，體內NE的增高程度和暴力行為的嚴重程度呈正相關［9］。NE對中樞神經以興奮為主，而5－HT則以抑制為主，兩者水平改變則分別引起情緒激動、急躁易怒與情緒低沉、抑郁寡歡。腦內的DA既是NE的前體，又是一種獨立的神經遞質，在結構和功能上與NE有密切聯系，在中樞神經系統中主要起著調控情緒的作用。這是從分子生物學角度對造模組大鼠出現一系列撕咬、打斗等焦慮、煩躁、易激惹的表現進行了解釋。而更年期高血壓燥證造模組大鼠較更年期高血壓組血清E2、T水平降低，E2/T升高，提示更年期高血壓燥證造模組大鼠體內內分泌環境的變化較大，可導致腦內β－內啡肽及5－HT水平異常，從而使精神、情緒變化失調，交感神經系統、體溫調節中樞不穩定，血管舒縮平衡失調，出現一系列自主神經功能紊亂。

更年期高血壓燥證造模大鼠證候在中醫理論中被認為是綜合功能狀態的反映，受到其特異性功能網絡的調控［10］。組織以及器官幾乎均參與了機體應激反應，這一過程主要通過交感－腎上腺髓質－下丘腦－垂體－甲狀腺軸－腎上腺皮質這類神經－內分泌通路為主來實現。本研究大鼠臟器(肝臟、脾臟、腎上腺、下丘腦)組織結構觀察結果顯示，與更年期高血壓大鼠比較，更年期高血壓燥證造模大鼠肝臟中央靜脈及肝竇輕度充血擴張，肝細胞中度增生，可見雙核及核分裂，肝細胞中度脂肪變性，枯否細胞輕度增生，間質少量淋巴細胞浸潤，說明肝臟損害進一步加重;脾竇輕度充血擴張，脾小體中央動脈輕度玻璃樣變;腎上腺結構不清，束狀帶排列紊亂，細胞膜不清晰，細胞質內含豐富類脂質，部分區域細胞壞死崩解，血竇充血擴張，部分區域見出血及含鐵血黃素沉著;下丘腦組織輕度充血水腫，膠質細胞明顯增生，少量淋巴細胞浸潤。提示內、外燥可能作用于交感－腎上腺髓質系統、下丘腦－垂體－腎上腺皮質系統軸，引起了大鼠臟器以及腦組織產生應激反應，因而在相應臟器以及腦組織呈現一定的病理性改變。

本研究結合更年期高血壓和燥證的現代認識，初步建立了基本符合中醫燥證理論的更年期高血壓燥證大鼠模型，以大鼠生物學特征的變化、血清神經遞質水平的變化及大鼠臟器組織結構的改變等作為評價指標，評價指標客觀。通過本研究對于更年期高血壓燥證大鼠模型的探索，摸索通過復合已有不同疾病(原發性高血壓病、更年期綜合征)以及中醫證型(燥證)動物模型，形成復合型疾病的中醫證型動物模型——更年期高血壓燥證大鼠模型，從而為進一步開展相應的實驗研究提供基礎。但由于中醫實驗研究仍處于起步發展階段，成熟的中醫動物模型以及量化標準尚十分不足，如何借鑒系統生物學的思路和方法，綜合運用中醫學、分子生物學、生物信息學、計算機科學等多種手段進一步進行研究，成為擺在中醫藥實驗研究領域的重要問題，需要進一步去交流、探索與研究。當然這些探索和實驗仍需要進一步完善和改進，并且仍然有一些高血壓相關疾病的動物模型沒有建立，這就需要繼續探索和不斷嘗試。

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Establishment of Climacteric Hypertension Dryness Syndrome Model in Rats

GE Li，LIN Xue，LI Hong－xia.Department of Hypertension，Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi830000，China

Objective To explore the method of the establishment of climacteric hypertension dryness syndrome model in rats.Methods A total of12 female spontaneously hypertensive rats(SHR)were selected as study subjects from January to March in 2014，SHR were randomly divided into climacteric hypertension group and climacteric hypertension dryness syndrome model group，there were 6 rats in each group.The bilateral ovaries of rats were removed by surgery，thus climacteric hypertension rats were obtained.Rats in climacteric hypertension dryness syndrome model group were placed in artificial dryness syndrome environment，and were fed with food from northwest area which may cause dryness syndrome.The biological characteristics(coat color，mental state，degrees of excitement，food intake，water intake，body mass，characters of urine and stool，tongue picture，claws picture)，serum levels of neurotransmitters〔corticotropin－releasing hormone(CRH)，adrenocorticotrophic hormone(ACTH)，norepinephrine(NE)，dopamine(DA)，5－hydroxytryptamine(5－HT)〕and hormones〔estradiol (E2)，testosterone(T)〕，and histological changes of organs(liver，spleen，adrenal gland，and hypothalamus)were observed and recorded.Results Compared with rats in climacteric hypertension group，the body mass and urine volume were significantly decreased，and water intake was significantly increased among rats in climacteric hypertension dryness syndrome model group，the differences were statistically significant(P＜0.05).Serum levels of CRH，NE，DA and 5－HT in climacteric hypertension dryness syndrome model group were significantly higher than those in climacteric hypertension group(P＜0.05).There was no significant difference in ACTH level between two groups(P＞0.05).Compared with rats in climacteric hypertension group，serum levels of E2and T were significantly decreased，and E2/T was significantly increased among rats in climacteric hypertension dryness syndrome model group，the differences were statistically significant(P＜0.05).The significanthistological changes of liver，spleen，adrenal gland，and hypothalamus were observed among two groups of rats.Conclusion The artificial dryness syndrome environment，food from northwest area which may cause dryness syndrome，combined with control of food and water intake can successfully turn climacteric hypertension rats into climacteric hypertension dryness syndrome rats model.

Hypertension;Climacteric;Dryness syndrome;Models，animal

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.30.013

2015－03－02;

2015－06－07)

(本文編輯:崔麗紅)

國家自然科學基金資助項目(81160430)

830000新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學附屬中醫醫院高血壓科

林雪，830000新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學附屬中醫醫院高血壓科;E－mail:linxueys@163.com