液體曲酒母制作工藝研究

隗程峰，陳茂彬，朱正軍，姚曉玲*

（湖北工業大學輕工學部食品與制藥工程學院，湖北武漢430068）

液體曲酒母制作工藝研究

隗程峰，陳茂彬，朱正軍，姚曉玲*

（湖北工業大學輕工學部食品與制藥工程學院，湖北武漢430068）

以粉碎的小麥為原料，對液體曲酒母制作工藝進行了研究，將粉碎的小麥加水調漿并進行碳源、氮源及無機鹽調配后接種黑曲霉，恒溫振蕩培養5 d后接種酵母，繼續恒溫振蕩培養一段時間制成液體曲酒母。以液體曲酒母的糖化力和發酵力為評價指標，采用單因素試驗和正交試驗探討了可溶性淀粉、NaNO3、KH2PO4及MgSO4添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響。結果表明，當可溶性淀粉添加量12 mg/mL、NaNO3添加量6 mg/mL、KH2PO4添加量4 mg/mL、MgSO4添加量0.5 mg/mL時，液體曲酒母具有最高品質，糖化力和發酵力為245.9 U、3.011 g/（mL·72 h），且在此條件下制作的液體曲酒母流動性好，適于工業化生產。

液體曲酒母；黑曲霉；酵母；糖化力；發酵力

黃酒被稱為世界三大古酒之一，其采用糯米為主要原料，由麥曲提供糖化劑和少量發酵劑，再加入酒母提供主發酵劑，經過一段時間的發酵而成，含有氨基酸、糖、醇、有機酸及多種維生素。《天工開物》中指出，“無曲，即佳米珍黍空造不成”，可見麥曲在黃酒的釀造過程中起著相當重要的作用，其制作工藝條件的控制就顯得尤為重要。目前，黃酒釀造所用曲主要是生麥曲和熟麥曲兩種，而在制曲過程中，生麥曲和熟麥曲的生產都存在著勞動強度大、生產條件難于控制、生產所占場地面積大等缺點［1-4］。

在黃酒的釀造過程中，麥曲為黃酒釀造提供各種酶類（主要是淀粉酶、蛋白酶等），這些酶促使原料所含的淀粉、蛋白質等高分子物質的水解，保證了黃酒發酵的正常進行；同時在制曲過程中霉菌的生長繁殖形成了各種代謝物以及由這些代謝產物相互作用產生的色澤、香味等，賦予黃酒酒體獨特的風格，保證了黃酒的品質及營養價值［3-5］。酵母在黃酒釀造中主要起發酵葡萄糖生成酒精的作用，一些研究者也十分重視酵母的選育工作，運用不同的方法選育得到了性狀更加優良的酵母，為黃酒口味多樣化奠定了理論基礎。為綜合前人的研究成果，考慮將霉菌及酵母在液體狀態下混合培養，制作出既具有糖化力又具有發酵力的液體曲酒母運用于黃酒發酵，從而能夠進一步簡化黃酒釀造工藝，節約釀造成本［5-15］。

本研究以小麥為原料，將小麥粉碎過目并加水調漿，在液態環境下接入霉菌及酵母并振蕩培養以制得液體曲酒母。這種方法減少了雜菌的污染，節約了廠房面積，運用于黃酒生產時簡化了黃酒釀造工藝，更加適于機械化黃酒生產。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

小麥、大米：武漢市武泰閘農貿市場；黑曲霉、酵母：本院實驗室保存；馬鈴薯葡萄糖培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，加水1 000 mL，pH自然。

可溶性淀粉、NaNO3、KH2PO4、NaCl、NaOH、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（分析純）：西隴化工股份有限公司；MgSO4、冰醋酸、葡萄糖、CuSO4·5H2O、亞甲基藍、乙酸鈉、濃硫酸、碘液（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；糖化酶、耐高溫α-淀粉酶：廣州市諾森生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

HK-04A粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；20目篩：浙江上虞市五四紗篩廠；DK-98-11電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；FE20型pH計：梅特勒托利多儀器有限公司；LDZX-75KB高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；ZHJHC1214B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；BCD-226冰箱：博西華家用電器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；AP-01P抽濾機：杭州賽析科技有限公司。

1.3方法

1.3.1霉菌液態種子液的制作

將試管斜面保藏的黑曲霉用10 mL無菌水溶解后，倒入盛有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養基的250 mL錐形瓶中，30℃、180 r/min恒溫搖床振蕩培養3 d，制成霉菌的液態種子液，備用。

1.3.2酵母液態種子液的制作

將試管斜面保藏的酵母用10mL無菌水溶解后，倒入盛有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養基的250 mL錐形瓶中，30℃、180 r/min恒溫搖床振蕩培養3 d，制成酵母的液態種子液，備用。

1.3.3液體曲酒母工藝

（1）工藝流程

小麥→除雜→粉碎過20目篩→加水調漿→調配（碳源、氮源、無機鹽）→冰醋酸調節pH4.6→煮沸使淀粉糊化→121℃、20min濕熱滅菌→冷卻后接種霉菌→恒溫箱振蕩培養5 d后接種酵母→同條件培養2 d→糖化力檢測、發酵力檢測

（2）操作要點

加水調漿：取粉碎過的小麥4.0 g于250 mL錐形瓶，加50 mL水。

調配：可溶性淀粉補充碳源，硝酸鈉補充氮源，磷酸二氫鉀、硫酸鎂補充黑曲霉生長所需的無機鹽。

冰醋酸調pH值：黑曲霉的最適生長pH值為4.6，將冰醋酸與水按1∶15的比例稀釋后調節pH值為4.6。

煮沸：在攪拌的狀態下煮沸2 min使小麥淀粉糊化。

滅菌：濕熱滅菌20 min。

接種霉菌：待溫度降至低于30℃后，在超凈工作臺上接種5 mL黑曲霉種子液。

恒溫振蕩培養：用兩層滅菌紗布封住瓶口，將錐形瓶置于30℃的恒溫培養箱中150 r/min振蕩培養5 d。

接種酵母：從培養箱中取出，在超凈工作臺上接種2mL酵母種子液。

同條件培養2 d：將錐形瓶置于30℃的恒溫培養箱中150 r/min振蕩培養2 d。

1.3.4液體曲酒母優化的單因素試驗設計

可溶性淀粉對液體曲酒母的糖化力及液化力的影響：按1.3.3的方法，設定硝酸鈉添加量4 mg/mL，磷酸二氫鉀添加量2 mg/mL，氯化鈉添加量0.02 mg/mL，硫酸鎂添加量0.2mg/mL，分別添加可溶性淀粉0、4mg/mL、8mg/mL、12mg/mL、16mg/mL、20mg/mL，考察可溶性淀粉對液體曲糖化力和發酵力的影響。

硝酸鈉對液體曲酒母的糖化力及液化力的影響：按1.3.3的方法，設定可溶性淀粉添加量12mg/mL，磷酸二氫鉀添加量2 mg/mL，氯化鈉添加量0.02 mg/mL，硫酸鎂添加量0.2 mg/mL，分別添加硝酸鈉2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL，考察硝酸鈉對液體曲糖化力和發酵力的影響

磷酸二氫鉀對液體曲酒母的糖化力及液化力的影響：按1.3.3的方法，設定可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸鈉添加量5 mg/mL，氯化鈉添加量0.02 mg/mL，硫酸鎂添加量0.2 mg/mL，分別添加磷酸二氫鉀0、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL，考察磷酸二氫鉀對液體曲糖化力和發酵力的影響。

硫酸鎂對液體曲酒母的糖化力及液化力的影響：按1.3.3的方法，設定可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸鈉添加量5 mg/mL，磷酸二氫鉀添加量3 mg/mL，氯化鈉添加量0.02 mg/mL，分別添加硫酸鎂0、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL，考察硫酸鎂對液體曲糖化力和發酵力的影響。

1.3.5液體曲酒母發酵培養基優化的正交試驗設計

在單因素試驗基礎上進行正交試驗，以糖化力及發酵力為指標進行L9（34）正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1　液體曲酒母發酵培養基優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for liquid wheat koji and yeast fermentation medium formula optimization mg/mL

1.3.6液體曲酒母的糖化力檢測

在35℃、pH4.6的條件下，1mL液體曲1h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的質量數（mg）為一個活力單位（U）。

（1）液體曲酒母糖化酶提取

取5 mL液體曲于100 mL容量瓶，加入10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用蒸餾水定容。置于35℃的水浴中振蕩提取1 h，過濾，收集濾液備用。

（2）糖化力測定

于甲、乙2個150 mL錐形瓶中各加入25 mL可溶性淀粉，再加入5 mL液體曲糖化酶提取液，乙瓶搖勻后封住錐形瓶口，置于35℃恒溫水浴中振蕩水解1h后加入1mL20%的NaOH溶液，甲瓶直接加入1 mL 20%的NaOH溶液。兩瓶搖勻后吸取5 mL混合液加入另一個盛有菲林試劑甲液、乙液各5 mL的150 mL錐形瓶中，再加入10 mL蒸餾水后置于電爐上加熱至沸騰，在沸騰的狀態下采用1 mg/mL的標準葡萄糖溶液滴至溶液變黃，記錄乙瓶消耗的標準葡萄糖體積V2，甲瓶消耗的標準葡萄糖體積V1。糖化力的計算公式如下：

式中：X為試樣的糖化力，U；V1為滴定空白時消耗的葡萄糖標準溶液的體積，mL；V2為滴定試樣時消耗的葡萄糖標準溶液的體積，mL；1（分子）葡萄糖溶液的質量濃度，mg/mL；30為糖化混合液的總體積（可溶性淀粉25 mL加液體曲提取液5 mL），mL；0.25為5 mL液體曲提取液相當于所取液體曲的體積；5為滴定時吸取的糖化液的體積，mL；1（分母）為酶解時間，h。

1.3.7液體曲酒母的發酵力檢測

在30℃、72h內，1mL液體曲酒母利用可發酵性糖類所產生的二氧化碳質量（g）為一個單位，以g/（mL·72h）表示。

（1）糖化液制備

取大米原料60 g，加水300 mL，混勻，加0.4 gα-淀粉酶煮沸20min，使其糊化。冷卻至60℃，加入3.2g糖化酶，再加60 mL預熱至60℃的水，攪勻，在60℃糖化至取出一滴與碘不顯藍為止，加熱煮沸5min，用8層紗布過濾，濾液備用。

（2）滅菌

取若干發酵瓶分別加入50 mL糖化液，塞上棉塞并包上油紙，記錄液面高度。同時用油紙包好發酵栓，一起放入滅菌鍋中121℃、20 min濕熱滅菌。

（3）發酵力測定

滅菌后的糖液冷卻至低于30℃，在無菌條件下加入制得的酒母1 mL，留一組作空白對照。發酵栓中加入5 mL濃硫酸封口，用石蠟密封發酵瓶，擦干瓶外壁，置于分析天平稱質量，讀數為M1（空白試驗讀數為M3）。置發酵栓于30℃恒溫箱發酵72 h，取出發酵瓶，輕輕搖動使二氧化碳全部逸出，再在同一天平稱質量，讀數為M2（空白試驗讀數為M4）。發酵力的計算公式如下：

式中：X為試樣的發酵力，g/（mL·72 h）；M1為發酵前發酵栓與內容物總質量，g；M2為發酵后發酵栓與內容物總質量，g；M3為空白試驗發酵前發酵栓與內容物總質量，g；M4為空白試驗發酵后發酵栓與內容物總質量，g。

2　結果與分析

2.1液體曲酒母優化單因素試驗結果

2.1.1可溶性淀粉添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響

圖1　可溶性淀粉添加量對液體曲糖化力及發酵力的影響Fig.1 Effect of soluble starch addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

從圖1可知，當可溶性淀粉添加量為0～12 mg/mL時，所制得的液體曲酒母糖化力及發酵力較低，曲香淡薄，可能是營養物質不夠，造成菌種生長緩慢，代謝物質較少。添加量為12 mg/mL時，所制得的液體曲具有最高的糖化力及發酵力，且曲香濃郁。當添加量為12～20 mg/mL時，糖化力、發酵力均呈下降趨勢，所制得的液體曲酒母顏色開始出現淡褐色，且酸味開始加重，可能是營養豐富，過早進入衰亡期所致。故選擇12mg/mL為最佳可溶性淀粉添加量。

2.1.2硝酸鈉添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響

圖2　硝酸鈉添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響Fig.2 Effect of NaNO3addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

由圖2可知，當硝酸鈉添加量為2～5 mg/mL時，糖化力及發酵力逐漸升高，當添加量繼續增加時，糖化力呈下降趨勢，而發酵力呈現平緩上升趨勢。添加量為5 mg/mL時，液體曲酒母的糖化力及發酵力均達到較佳水平。綜合考慮，選擇5 mg/mL為最佳硝酸鈉添加量。

2.1.3磷酸二氫鉀添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響

圖3　磷酸二氫鉀添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響Fig.3 Effect of KH2PO4addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

由圖3可知，磷酸二氫鉀的添加量對糖化力及發酵力的影響較小，添加量為0～3 mg/mL時，糖化力及發酵力均呈緩慢上升趨勢，當添加量為3～5 mg/mL時，糖化力及發酵力呈緩慢下降的趨勢。故選擇3 mg/mL為最佳磷酸二氫鉀添加量。

2.1.4硫酸鎂添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響

圖4　硫酸鎂添加量對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響Fig.4 Effect of MgSO4addition on saccharifying and fermenting power of liquid wheat koji and yeast

由圖4可知，當硫酸鎂添加量為0～0.2 mg/mL時，液體曲酒母糖化力及發酵力均呈上升趨勢。之后再增加硫酸鎂添加量時液體曲酒母糖化力呈下降趨勢，而發酵力呈現緩慢上升趨勢。綜合考慮，選擇0.2 mg/mL為液體曲酒母制作的最佳添加量。

2.2液體曲酒母制作工藝優化正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇可溶性淀粉添加量（A）、硝酸鈉添加量（B）、磷酸二氫鉀添加量（C）、硫酸鎂添加量（D）4個因素，以糖化力及發酵力為考察指標，進行4因素3水平L9（34）正交試驗，試驗結果與分析見表2，方差分析見表3、表4。

表2　液體曲酒母發酵培養基優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for liquid wheat koji and yeast fermentation medium formula optimization

表3　以糖化力為考察指標正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments using saccharifying power as evaluation index

表4　以發酵力為考察指標正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments using saccharifying power as evaluation index

從表2可以看出，4個因素對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響由大到小均為可溶性淀粉添加量＞硝酸鈉添加量＞硫酸鎂添加量＞磷酸二氫鉀添加量。且由極差分析結果表明，可溶性淀粉添加量、硝酸鈉添加量、磷酸二氫鉀添加量、硫酸鎂添加量最優的水平組合均為A2B2C3D3，即可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸鈉添加量6 mg/mL、磷酸二氫鉀添加量4mg/mL、硫酸鎂添加量0.5mg/mL。液體曲酒母的糖化力達到245.9U，發酵力達到3.011g/（mL·72h）。

糖化力及發酵力的方差分析（表3、表4）表明可溶性淀粉對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響顯著，其他因素的影響均不顯著。

從表2可以看出，4個因素對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響由大到小均為可溶性淀粉添加量＞硝酸鈉添加量＞硫酸鎂添加量＞磷酸二氫鈉添加量。且以發酵力及糖化力為考察指標，由極差分析結果表明，可溶性淀粉添加量、硝酸鈉添加量、磷酸二氫鈉添加量、硫酸鎂添加量最優的水平組合均為A2B2C3D3，即可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸鈉添加量6 mg/mL、磷酸二氫鉀添加量4 mg/mL、硫酸鎂添加量0.5 mg/mL。在此條件下進行驗證試驗，結果表明，液體曲酒母的糖化力可以達到245.9 U，發酵力可以達到3.011 g/（mL·72 h）。糖化力及發酵力的方差分析（表3、表4）表明可溶性淀粉對液體曲酒母糖化力及發酵力的影響顯著，其他因素的影響均不顯著。

3　結論

液體曲酒母能為黃酒發酵同時提供所需的糖化力和發酵力，以小麥為原料制作液體曲酒母能為黃酒提供特殊的香味物質和營養成分，使黃酒具有絕佳的口感和極高的營養價值。在單因素試驗基礎上，以液體曲酒母的糖化力和發酵力為考察指標，采用單因素及正交試驗，得出結論：液體曲酒母制作是可行的；最終液體曲酒母調配階段的最佳方案可溶性淀粉添加量12 mg/mL，硝酸鈉添加量6 mg/mL、磷酸二氫鉀添加量4 mg/mL、硫酸鎂添加量0.5 mg/mL。以此方法制作的液體曲曲香濃郁、流動性好。將其用于工業化黃酒生產不僅易于控制制曲條件，更是簡化了黃酒生產工藝、節約了黃酒生產成本，減小了勞動強度，節約了廠房面積，其產業化前景廣闊。

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Preparation processing of liquid wheat koji and yeast

WEI Chengfeng，CHEN Maobin，ZHU Zhengjun，YAO Xiaoling*
（College of Food and Pharmaceutical Engineering，Division of Light industry，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

With crushed wheat as raw material，the process of liquid wheat koji was studied.The crushed wheat was added with water，blended with carbon source，nitrogen source and inorganic salt，then inoculated withAspergillus niger.After shaking cultivation at constant temperature for 5 d，wheat koji was inoculated with yeast and then cultivated for a period of time in the constant temperature and shocked environment，the liquid wheat koji and yeast was made.Using saccharifying power and fermenting power of liquid wheat koji as evaluation index，the effect of soluble starch，NaNO3，KH2PO4and MgSO4addition on saccharifying power and fermenting power of liquid wheat koji and yeast was investigated through single factor and orthogonal test.The result showed that the koji has the optimal saccharifying power and fermenting power when the soluble starch，NaNO3，KH2PO4and MgSO4addition in order were 12 mg/ml，6 mg/ml，4 mg/ml，0.5 mg/ml，and the koji and yeast had good saccharifying power of 245.9 U and fermenting power of 3.011 g/（ml·72 h），the yeast made at this condition had good fluidity and was suitable for industrial production.

liquid wheat koji and yeast；Aspergillus niger；yeast；saccharifying power；fermenting power

TS261.1

B

0254-5071（2015）10-0068-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.015

2015-09-01

湖北省科技支撐計劃（2013BBA010）

隗程峰（1990-），男，碩士研究生，主要從事食品研究工作。

姚曉玲（1962-），女，教授，博士，主要從事食品研究工作。