披針葉黃華中2株蠕形分生孢子內生真菌的鑒定

孫大林等

摘要：對披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）中分離的編號為SP01、RM02的2株蠕形分生孢子內生真菌進行種屬分類鑒定。觀察真菌的形態，提取真菌DNA，擴增并測定其ITS、GAPDH序列，構建系統發育樹，結合形態特征和遺傳進化分析結果，并對其進行種屬分類。結果表明，SP01菌株的形態特征與凸臍孢屬（Exserohilum）中的E. rostratum最為相似，與E. rostratum的遺傳進化關系最為密切；RM02菌株的形態特征與彎孢屬（Curvularia）中C. spicifera、C. australiensis最為相似，與C. spicifera的遺傳進化關系最為密切。確定披針葉黃華中分離的SP01、RM02分別為E. rostratum和C. spicifera。

關鍵詞：披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）；內生真菌；蠕形分生孢子真菌；鑒定

中圖分類號：S432 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4473-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.021

近年研究表明，諸多藥用植物內生真菌能夠合成具有生物活性作用的次生代謝產物[1-4]，通過人工選育和體外培養，該類真菌可以大量合成各種生物活性物質[5]，是新型藥物開發的重要資源。此外，內生真菌與宿主植物間存在著復雜的共生關系，具有提高植物抗病抗逆性、促進植物生長發育、維持微生態環境平衡等重要作用[6]。

披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）為豆科黃華屬多年生草本植物，廣泛分布于我國東北、華北及西北等省區的半干旱和干旱地區，該植物根系發達、耐寒抗旱、抗風沙、繁殖力強，具有重要的生態利用價值。此外，披針葉黃華也是一種藥用植物資源，該植物富含黃華堿、臭豆堿、野決明堿、金雀花堿等多種喹喏里西啶類生物堿，具有抗癌、抗心率失調、抑菌消炎等多種生物活性作用，民間用于多種疾病的治療[7]。目前尚未見到關于披針葉黃華內生真菌的相關報道。在前期研究中，本實驗室對采自寧夏的披針葉黃華內生真菌的多樣性進行了研究，從中分離到2株具有蠕形分生孢子真菌形態特征的內生真菌。真菌學界將分生孢子形似蠕蟲的半知菌稱為蠕形分生孢子真菌（Helminthosoiroid fungi），屬半知菌絲飽綱（Hyphomyeetes）暗色菌科，主要包括平臍蠕孢屬（離蠕孢屬）、彎孢屬、內臍孢屬、凸臍蠕孢屬、長蠕孢屬和卵蠕孢屬6個屬。該類真菌寄主范圍寬、分布廣泛，是一類具有重要經濟意義的真菌類群[8]。本研究擬對分離自披針葉黃華植物組織中的2株蠕形分生孢子真菌進行形態和遺傳發育分析，根據真菌的形態特征及內部轉錄間隔區序列（Internal transcribed space，ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）序列等信息，對其進行了種屬分類，為進一步研究披針葉黃華內生真菌的多樣性、次生代謝產物及與宿主植物的相互作用關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2013年8月于寧夏銀川市采集無病害披針葉黃華的根和種子，分離出SP01和RM02菌株，保存于北方民族大學國家民委發酵和釀造工程重點實驗室。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 6.5。水瓊脂+麥稈培養基（TWA+W）：瓊脂13 g，去離子水1 000 mL，pH 6.5，制成平板后，放入滅菌麥稈。

1.1.3 儀器與試劑 C1000型PCR儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；5418型高速離心機（德國Eppendorf公司）；DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國OMEGA公司）；DNA聚合酶、DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）；其他有機試劑為國產分析純。

1.2 真菌的形態觀察

將SP01、RM02菌株接種于PDA、TWA+W培養基上培養，挑取菌絲至載玻片上，經乳酸酚棉蘭染液染色后在顯微鏡下觀察。用目鏡測微尺測量分生孢子的大小和菌絲的直徑，根據真菌的菌絲、分生孢子、分生孢子梗的形態特點及產孢方式等對其進行初步的種屬分類。

1.3 真菌ITS、GAPDH序列的擴增及遺傳進化分析

分別取PDA培養基上培養15 d的真菌菌絲約200 mg，置于冰中放置的1.5 mL離心管中，用帶有玻璃研磨鉆頭的電鉆間歇研磨菌絲約20 s，然后用DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA。應用White等[9]報道的引物ITS1和ITS4擴增ITS序列，應用Berbee等[10]報道的引物gpd1和gpd2擴增GAPDH序列。PCR反應體系均為50 μL，其中DNA聚合酶2.5 U，PCR緩沖液5 μL，dNTP 4 μL，20 μM引物各2 μL，模板DNA 0.5 μL。具體反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃ 10 min使其反應充分。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，確定成功擴增的產物進行凝膠純化回收，將純化的PCR產物送上海生工生物工程股份有限公司，分別以ITS1、ITS4引物和gpd1、gpd2引物進行雙向測序，將正反測序結果拼接，獲得ITS和GAPDH序列信息。

登錄http//：www.ncbi.nlm.nih.gov，將已獲得的各菌株ITS序列和GAPDH序列提交到GenBank，申請GenBank序列號。應用BLAST在線比對程序分別將測定的ITS序列和GAPDH序列與數據庫中已提交的真菌序列進行同源性比較，獲得各菌株的種屬初步分類信息；選擇數據庫中相關屬或臨近屬權威菌株的ITS序列和GAPDH序列（表1），應用MEGA 4.0軟件中的Clustal W程序對各序列進行聯配（Aligment），然后根據聯配結果采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，自展數據集為1 000。

1.4 真菌的種屬分類

根據各菌株菌絲、分生孢子及分生孢子梗的形態特點，產孢方式、生長特性，并結合ITS、GAPDH序列同源性比較和遺傳進化分析結果，對該類真菌進行種屬分類。

2 結果與分析

2.1 SP01和RM02菌株的形態特征

SP01菌株在PDA培養基上菌落呈灰黑色，在TWA+W培養基上呈灰褐色。菌絲無色，分生孢子梗呈深褐色，上部屈膝狀彎曲，未見分支。分生孢子呈淺褐色或深褐色，單生于分生孢子梗頂端或側部，呈圓柱狀，略彎曲，兩端鈍圓，孢子大小約為（60～90） μm×（13～16） μm，一端具臍點，突出于孢子表面。孢子具有6～9個假膈膜，兩端膈膜較厚，顏色較深（圖1a）。

RM02菌株在PDA培養基上菌落呈灰綠色，在TWA+W培養基上呈灰褐色。菌絲無色，在以上2種培養基上，該菌株均只能產生少量的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗呈淡褐色，上部屈膝狀彎曲，偶見分支。分生孢子呈淺褐色，單生或簇生，呈橢圓形，孢子平直，兩端鈍圓，孢子大小約為（10～24） μm×（7～10） μm，一端具臍點，與孢子壁表面平齊。孢子具有3個假膈膜（圖1b）。

2.2 SP01、RM02菌株ITS、GAPDH的遺傳進化分析結果

SP01、RM02菌株的ITS、GAPDH片段的核苷酸序列測定結果顯示，SP01、RM02的ITS片段長度分別為601 bp、570 bp，GAPDH片段長度分別為524 bp、530 bp，其ITS序列的GenBank登錄號分別為KP245767、KP245754，GAPDH序列的GenBank登錄號分別為KP311327、KP311328。

BLAST比對結果顯示，SP01菌株的ITS、GAPDH序列與凸臍孢屬（Exserohilum）的E. rostratum及其有性型Setosphaeria rostrata的序列一致性最高，均達99%。RM02菌株的ITS序列與彎孢屬（Curvularia）的C. spicifera、C. australiensis、C. hawaiiensis等菌株的序列一致性最高，為98%～100%。

基于ITS序列構建的NJ系統發育樹（圖2）表明，SP01菌株與Exserohilum屬的各菌株在系統發育樹中同處于一個分支，自檢支持率高達99%，其中與E.rostratum ITF0706-2及E.rostratum的有性型S.rostrata IP 1129.80、S.rostrata Ex007、S.rostrata ATCC 32197等菌株遺傳進化關系最為密切。RM02菌株與Curvularia屬的各菌株在系統發育樹中同處于一個分支，其中與C.spicifera的DAOM 575355、YW1、BC21ss2、CBS 274.52等菌株及C.spicifera的同物異名菌株C.tetramera CBS 371.72處于同一個分支，說明RM02菌株與C.spicifera的遺傳進化關系最為密切。

基于GAPDH序列構建的NJ系統發育樹（圖3）表明，SP01菌株與Exserohilum屬的各菌株在系統發育樹中同處于一個分支，自檢支持率也較高，其中與E.rostratum ITF0706-2及E.rostratum的有性型S.rostrata ATCC 32197、S.rostrata ACCC 37579等菌株遺傳進化關系最為密切。RM02菌株與Curvularia屬的各菌株在系統發育樹中同處于一個分支，其中與C.spicifera的DAOM 575355、BC21ss2、CBS 274.52等菌株處于同一個分支，說明RM02菌株與C.spicifera的遺傳進化關系最為密切。

3 小結與討論

在本研究中，SP01菌株的分生孢子呈長圓柱形，具有多個假膈膜，孢子兩端膈膜較厚且顏色較深，孢子一端具臍點，臍點明顯突出于孢子外壁表面，孢子頂生或側生，這些形態特點與Exserohilum中的E.rostratum較為相似[8]。此外，基于ITS、GAPDH序列構建的系統發育樹也表明，SP01與Exserohilum各種同屬于一個類群，且與E.rostratum的遺傳進化關系最為密切。因此，本研究將SP01鑒定為E.rostratum（嘴突凸臍蠕孢）。

RM02菌株的分生孢子呈橢圓形，具3個假膈膜，孢子平直，兩端鈍圓，孢子一端具臍點，臍點與孢子壁表面平齊，該菌具有平臍孢屬（Bipolaris）和彎孢屬（Curvularia）真菌的典型特征，其中與平臍孢屬真菌B.spicifera、B.australiensis最為相似[8]。基于ITS、GAPDH序列構建的系統發育樹表明，RM02菌株與彎孢屬（Curvularia）菌株處于同一類群，與C.spicifera、C.australiensis、C.hawaiiensis遺傳進化關系較近，其中與C.spicifera遺傳進化關系最近。而C.spicifera、C.australiensis、C.hawaiiensis分別是B.spicifera、B.australiensis、B.hawaiiensis的同物異名，故本研究將RM02鑒定為C.spicifera≡Bipolaris spicifera（長穗離蠕孢）[11，12]。

在蠕形分生孢子真菌中，突出的臍點是凸臍孢屬區別于平臍孢屬、內臍孢屬等其他蠕形菌的最典型特征。但在實際觀察中，真菌的形態變異較大，受培養條件的影響較大，僅據此來區分它們容易造成混淆。彎孢屬和平臍孢屬的相似程度很高，而且具有相同的有性型-旋孢腔菌屬（Cochliobolus）。有學者認為分生孢子是否彎曲或分生孢子的膈膜類型可作為區分彎孢屬和平臍孢屬的重要依據[11]。但本研究表明，平臍孢屬中的某些種的孢子也會出現彎曲，而彎孢屬中的某些種的孢子是直的。Alcorn認為Bipolaris的分生孢子的膈膜為假膈膜，而Curvularia的膈膜為真膈膜，Bipolaris、Curvularia應為兩個獨立的屬[12]。但Sivanesan認為，Curvularia中的未成熟或成熟的孢子中其膈膜并未與外壁相連，也是假膈膜[13]。因此，僅根據真菌的形態很難將2個屬中的各個種嚴格區分開來[8]。

近年來，在傳統形態分類學的基礎上發展而來的核苷酸序列遺傳進化分析技術為真菌的種屬分類提供了必要的技術手段，如ITS、GAPDH、LSU、EF-1α、Brn1等序列已廣泛用于蠕形分生孢子真菌的系統發育研究[8]。Li等[11]、Manamgoda等[12]對Bipolaris、Curvularia真菌的ITS、GAPDH序列進行了遺傳進化分析，結果表明，Bipolaris和Curvularia的各個種均被分別劃分到Cochliobolus的2個類群中。Manamgoda等[13]、Tan等[14]根據ITS、GAPDH、EF-1α等序列的遺傳進化分析結果，對Bipolaris、Curvularia中的各種進行了重新劃分，其中將B. spicifera、B.australiensis、B. hawaiiensis等明確劃分到Curvularia中。在本研究中，基于ITS、GAPDH序列構建的系統發育樹均將B.spicifera、B.australiensis、B.hawaiiensis劃分到Curvularia類群中，與Bipolaris類群明顯處于不同的進化樹分支，這與Brebee等[10]、Manamgoda等[13]的報道相一致。據Shimizu等[15]、Sun等[16]、孫廣宇等[17]報道，Brn1序列適用于對Exserohilum、Bipolaris、Curvularia中不同菌株的遺傳變異分析，而且能夠區分E.rostratum中的種間變異。本研究的結果表明，ITS、GAPDH序列也適用于對Exserohilum各種的區分。

參考文獻：

[1] ZHAO J，ZHOU L，WANG J，et al. Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants[J].A. Méndez-Vilas （Ed.） Current Research，Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology，2010，1：567-576.

[2] STIERLE A，STROBEL G，STIERLE D B. Taxonl and taxane production by Taxomyces andreana， an endophytic fungus of pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.

[3] 蘇經遷，黃 彬，邱 慧，等.產生物堿和石杉堿甲蛇足石杉內生真菌的初步研究[J].中國藥學雜志，2011，46（19）：1477-1481.

[4] 孫建秋，郭良棟，臧 威，等.藥用植物內生真菌多樣性及生態分布[J].中國科學C輯：生命科學，2008， 38（5）：475-484.

[5] BANDARA W M M S，SENEVIRATNE G，KULASOORIYA S A. Interactions among endophytic bacteria and fungi： Effects and potentials[J].Journal of Biosciences，2006，31（5）：645-650.

[6] 袁志林，章初龍，林福呈.植物與內生真菌互作的生理與分子機制研究進展[J].生態學報，2008，28（9）：4430-4439.

[7] 李 勇，趙曉瑞，張學禮.披針葉黃華的化學成分研究[J].農業科學研究，2008，29（4）：68-69.

[8] 張天宇，孫廣宇.中國真菌志（第三十卷）[M].北京：科學出版社，2010.

[9] INNIS M A，GELFAND D H，SNINSKY J J，et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M].New York：Academic Press，1990.315-322.

[10] BERBEE M L，PIRSEYEDI M，HUBBARD S. Cochliobolus phy-logenetics and the origin of known， highly virulent pathogens， inferred from ITS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene sequences[J].Mycologia，1999，91（6）：964-977.

[11] LI K N，ROUSE D I，GERMAN T L. PCR primers that allow intergeneric differentiation of ascomycetes and their application to Verticillium spp.[J]. Appl Environ Microbiol，1995，60 （12）：4324-4331.

[12] MANAMGODA D S，CAI L，BAHKALI A H，et al. Cochliobolus：An overview and current status of species[J].Fungal Divers，2011，51（1）：3-42.

[13] MANAMGODA D S，CAI L，CROUS P W，et al. A phylogenetic and taxonomic re-evaluation of the Bipolaris-Cochliobolus-Curvularia Complex[J]. Fungal Diversity，2012，56（1）：131-144.

[14] TAN Y P， MADRID H， CROUS P W， et al. Johnalcornia gen. et. comb. nov.， and nine new combinations in Curvularia based on molecular phylogenetic analysis[J]. Australasian Plant Pathol， 2014， 43（6）：589-603.

[15] SHIMIZU K， TANAKA C， PENG Y L， et al. Phylogeny of Bipolaris inferred from nucleotide sequence of Brn1， a reductase gene involve in melanin biosynthesis[J]. J Gen Appl Microbiol， 1998， 44（4）：251-258.

[16] SUN G Y，OIDE S，TANAKA E，et al. Species separation in Curvularia "geniculata" group inferred from Brn1 gene sequences[J].Mycoscience，2003，44（3）：239-244.

[17] 孫廣宇，張雅梅，張 榮.突臍孢屬Brn1基因核苷酸序列比較及系統發育研究[J].菌物學報，2004，23（4）：480-486.