不同低溫脅迫下葡萄枝條抗寒生理指標的分析

肖東明等

摘要：為了探究低溫脅迫對葡萄（Vitis L.）枝條相關生理指標的影響，試驗以抗寒山葡萄左優紅（V. amurensis Rupr. cv. Zuoyouhong）與不抗寒歐洲葡萄赤霞珠（V. vinifera L.cv. Cabernet Sauvignon）枝條為試材，比較了不同溫度（25、5、-5、-15 ℃）對葡萄枝條內超氧化物歧化酶、過氧化物酶與谷胱甘肽過氧化物酶活性以及總酚、木質素與纖維素含量的影響。結果表明，隨著處理溫度的降低，枝條中的超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性均呈現先上升后下降的變化趨勢；總酚含量呈逐步減少的趨勢，且2種葡萄之間存在差異；纖維素含量呈先上升后下降的趨勢，與超氧化物歧化酶變化規律基本一致，木質素含量變化無明顯規律，谷胱甘肽過氧化物酶經過低溫處理后酶活性得到明顯提高。

關鍵詞：葡萄（Vitis L.）；枝條；溫度；抗寒力；生理指標

中圖分類號：S663.1；Q944.55；Q948.112+.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4509-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.030

葡萄（Vitis L.）是全球重要的果樹種類之一，主要分布于北緯30°～50°區間，被廣泛用于釀酒、制汁、制干與鮮食。中國的葡萄產區主要集中在北方地區，低溫冷害是北方葡萄生產中存在的主要問題，發生凍害的樹體需要一年或者多年才能恢復，嚴重的甚至導致樹體死亡，造成產量和品質的波動，致使生產者蒙受經濟損失[1]。寧夏回族自治區葡萄產區作為全國最大的釀酒葡萄產地，其釀酒葡萄面積高達3萬hm2。該地區晝夜溫差大，光照充足，葡萄產量高、品質好，在中國葡萄產地中具有獨特的優勢；但是當地的嚴寒氣候是制約鮮食葡萄及釀酒葡萄大規模生產的重要限制因子。在葡萄的生長過程中，防止葡萄在低溫氣候中發生凍害是葡萄種植中最關鍵的一步。目前，寧夏葡萄產區越冬防寒的主要措施是采用埋土來防寒，盡管這樣做取得了一定的效果，但是冬季埋土防寒、春季出土上架造成了勞動力與財力的大量消耗，不僅增加了果農的生產成本，并且在一定程度上破壞了葡萄園的生態環境。

因此，有必要對葡萄自身的抗寒性能進行系統深入研究。國內外有關葡萄抗寒性的研究已有很多報道，在低溫脅迫下，葡萄體內的滲透調節物質、保護酶活性、丙二醛、脯氨酸等生理生化產物均會產生變化，并被作為葡萄抗寒性鑒定的篩選指標。試驗以不抗寒的歐洲釀酒葡萄品種赤霞珠（V. vinifera L.cv. Cabernet Sauvignon）與抗寒山葡萄品種左優紅（V. amurensis Rupr. cv. Zuoyouhong）為研究對象，通過模擬不同低溫脅迫條件，測定一年生葡萄枝條的有關抗寒生理指標，包括總酚、木質素、纖維素含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性，旨在比較分析低溫脅迫下葡萄枝條相關抗寒生理指標的變化規律，了解這些調節物質與抗寒性的關系，從而探索它們與低溫脅迫、抗寒能力的相關性，并對葡萄抗寒性鑒定的生理生化指標進行篩選，同時為培養葡萄抗寒新品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗在寧夏大學葡萄與葡萄酒工程研究中心玉泉營實驗基地進行采樣，該地位于北緯38°12′，東經105°99′；參試的赤霞珠和左優紅植株都為定植于園內的五年生成年樹。在2013年9月3日進行采樣，從生長勢一致的植株上收集一年生枝條，從基部第六節開始，每株剪取長40～50 cm、粗0.9～1.1 cm的枝條若干，剪取后用自來水、蒸餾水先后沖洗數次，用潔凈的紗布擦干，兩端封蠟，塑封后置于冰盒帶回實驗室。

1.1.2 試劑 試劑主要有福林肖卡溶液、飽和碳酸鈉、磷酸緩沖液、重鉻酸鉀、愈創木酚、甲基氨酸、氮藍四唑、核黃素、乙二胺四乙酸、乙醇、酸性茚三酮、冰醋酸、濃硫酸、硝酸、鹽酸、雙氧水、偏磷酸、丙酮、乙醚、硫代硫酸鈉、碘化鉀、磺基水楊酸等。

1.2 處理

在寧夏大學葡萄與葡萄酒工程研究中心實驗室將樣枝用蒸餾水沖洗干凈，均勻分為4份，其中3份分別在-15、-5、5 ℃的冰箱中進行冷凍（藏）處理。降溫至設定溫度后持續24 h，之后將-5、-15 ℃處理的樣品統一放置在5 ℃環境中解凍4 h；另外1 份作為對照，在室溫（25 ℃）下放置24 h；然后選取不同處理的枝條進行相關指標測定。

1.3 抗寒生理指標測定

將參試樣品分為兩部分，其中一部分枝條放置于通風口處使其自然脫水，直至枝條干重不再發生變化，用組織破碎機粉碎，得到的粉末狀物過40 mm篩后，低溫儲存備用。另外一部分葡萄枝條用蒸餾水沖洗干凈，避開芽眼，剪成薄片，混合均勻，取材料2.0 g切碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿，低溫離心之后，取上清液測定有關生理指標。總酚含量采用福林肖卡法[2-4]測定，纖維素含量采用硫酸與重鉻酸鉀氧化法測定[5]，木質素含量采用醋酸分離與硫酸水解法測定[6]，POD活性采用愈創木酚法測定[7]，SOD活性采用氮藍四唑法測定[7]，GSH-Px活性采用DTNB法測定[8]。

1.4 數據分析

試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2003軟件進行處理和繪圖，采用DPS 7.05統計分析軟件進行數據分析與差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對不同葡萄品種枝條總酚含量的影響

植物體內的酚類物質是一類天然的自由基清除劑，具有很強的抗氧化活性；在嚴寒惡劣的環境里，這些酚含量會增加，以抵御或減少低溫脅迫使植物體內所產生的自由基和活性氧對植物組織的傷害[9]。試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條總酚含量的影響情況見圖1。從圖1可見，低溫脅迫明顯抑制了葡萄枝條內可溶性總酚物質的積累，隨著低溫脅迫強度的加大，2個品種的可溶性總酚含量呈現出逐步降低的變化趨勢，在常溫對照中，赤霞珠與左優紅枝條內的總酚含量達到最高值，分別為26.60、38.94 mg/g，隨后一路下降，且在-15 ℃的低溫脅迫下達到最低值，此時2個品種與常溫處理相比，枝條內的總酚含量都降低了50%以上，并且2個品種在5、-5、-15 ℃處理后的總酚含量與對照相比多數處理差異極顯著（P<0.01），只有赤霞珠在5 ℃處理后的可溶性總酚含量與對照相比差異顯著（P<0.05）。通過以上數據可以看出，外界溫度對葡萄植株體內總酚含量的影響還是較為明顯的，而且品種之間存在差異，左優紅的可溶性總酚含量一直高于赤霞珠。

2.2 低溫處理對不同葡萄品種枝條纖維素含量的影響

試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條纖維素含量的影響情況見圖2。從圖2可見，赤霞珠與左優紅枝條的纖維素含量均表現先上升、后下降的變化趨勢，并在-5 ℃處理后達到高值（-15 ℃處理后稍有回落），其纖維素含量分別從常溫處理的26.43%、27.19%升至-5 ℃處理的40.81%、43.73%。其中赤霞珠、左優紅在5 ℃處理后枝條纖維素含量與對照相比差異顯著（P<0.05），而2個品種在-5、-15 ℃處理后枝條纖維素含量與對照相比差異極顯著（P<0.01）。

2.3 低溫處理對不同葡萄品種枝條木質素含量的影響

在低溫脅迫環境下，植物體內的酚類物質會有所增加，同時這些酚類物質隨后會在細胞壁中轉化成為木質素或木栓質[9]。試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條木質素含量的影響情況見圖3。從圖3可見，低溫處理后，赤霞珠的枝條木質素含量與對照相比，起伏較大，其在-5 ℃處理后枝條木質素含量達到高點（43.28%），此時高于對照，與對照相比差異極顯著（P<0.01），但在5、-15 ℃處理后木質素含量都明顯低于對照。而左優紅的枝條木質素含量在低溫處理后都比對照高，其中在5 ℃處理后枝條木質素含量達到高點（48.19%），與對照相比差異極顯著（P<0.01）。

2.4 低溫處理對不同葡萄品種枝條POD活性的影響

試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條POD活性的影響情況見圖4。從圖4可見，低溫處理后，2個品種枝條的POD活性均出現了先上升、后下降的變化趨勢。其中赤霞珠的枝條在5 ℃處理后達到酶活性的最高點，為16.142 μg/g，與對照相比差異極顯著（P<0.01）；此后POD活性逐漸下降，與對照相比差異不顯著（P>0.05）。左優紅的枝條POD活性在5 ℃處理后達到酶活性高點，與對照相比差異極顯著（P<0.01）；在-5 ℃處理后酶活性下降，與對照相比差異顯著（P<0.05）；在-15 ℃處理后POD活性繼續下降，與對照差異不顯著（P>0.05）。

2.5 低溫處理對不同葡萄品種枝條SOD活性的影響

試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條SOD活性的影響情況見圖5。從圖5可見，低溫處理后，2個品種枝條的SOD活性總體呈現出先上升、后下降的變化趨勢。在常溫條件下，左優紅的SOD活性高于赤霞珠。受到5 ℃低溫脅迫后，赤霞珠的SOD活性快速提升，與對照差異極顯著（P<0.01）；而左優紅提升的相對緩慢，與對照差異顯著（P<0.05）。在-5 ℃處理后，赤霞珠與左優紅的SOD活性都達到高值，分別為123.34、128.84 U/g，與對照差異極顯著（P<0.01）。在-15 ℃處理后，赤霞珠與左優紅的SOD活性都隨之回落，但SOD活性仍維持在高于對照的水平，赤霞珠的酶活性與對照差異顯著（P<0.05），左優紅的酶活性與對照差異極顯著（P<0.01），說明低溫處理還是可以提高葡萄的抗寒性能的。

2.6 低溫處理對不同葡萄品種枝條GSH-Px活性的影響

GSH-Px作為一種重要的抗氧化酶，能夠清除植物體內的自由基，從而減緩植物在逆境脅迫中所受到的傷害。試驗測定的低溫處理對不同葡萄品種枝條GSH-Px活性的影響情況見圖6。從圖6可見，2個品種對照處理的GSH-Px活性相對較低，隨著溫度的降低，2個品種枝條中的GSH-Px活性表現出跨越式的提升。在5 ℃脅迫后赤霞珠與左優紅的GSH-Px活性就達到高值，分別為18.56、17.81 kU/g，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。此后，在低溫脅迫程度繼續加劇的情況下，2個品種的GSH-Px活性出現少許回落，但維持在較高的水平，并仍然與比照差異極顯著（P<0.01）。

3 小結與討論

植物在逆境條件下能夠通過調節體內一系列生理生化過程來提高對逆境的抵御能力，并且在一定強度的溫度下，通過誘導植株細胞的代謝活動向著適應低溫、增加抗寒性的方向發展。試驗中，葡萄品種赤霞珠、左優紅枝條的POD活性隨著脅迫溫度的降低呈現逐步降低的變化趨勢，而SOD活性則是先上升、后下降，這與魯金星等[8]的研究結果一致；與未經過低溫處理的枝條（對照）相比，經過處理的枝條其SOD與POD的活性得到了一定的提升。在低溫脅迫條件下，植物體內會超常積累活性氧自由基[10，11]，而這些物質的積累加劇了膜脂過氧化，從而導致膜系統受損，最終破壞植物組織。在植物的保護酶系統中，SOD的作用是清除超氧自由基·O2-，同時產生歧化性產物H2O2；而POD的主要作用是酶促降解H2O2，使身處逆境脅迫下的植物能夠對代謝過程產生的有害物質進行抵御，表現出一定的抗逆性[12]，所以POD活性的高低體現了植物抗寒力的強弱[13]。低溫誘導可使葡萄細胞內防御活性氧的酶促保護系統能力增強，從而維持細胞膜的穩定性，提高了葡萄的耐寒性。

酚類物質是一類作用很強的自由基清除劑，在嚴寒時節，酚含量增加可以消除低溫使植物體內產生的自由基和活性氧對植物的傷害[14]；試驗里葡萄枝條中的總酚含量隨著脅迫溫度的降低而逐漸減少；但王麗雪等[15]、王靜[16]在研究植物葉片后發現多酚物質會在溫度逐漸降低的條件下大幅增加，并且半致死溫度低，抗寒性強。本試驗結果與之結論相悖，推測可能是由于枝條中的總酚轉移到了葉片中所致；從理論上說，清除自由基和活性氧有助于提高植物的抗寒性，但酚類物質的結構復雜、種類繁多[14，17]，具體哪種酚類物質在低溫下起保護作用，是否能作為反映植物抗寒性的一個指標，還需要進一步試驗論證。

低溫脅迫下植物體內的酚類化合物合成加速，這些酚類物質隨后會進入細胞壁間而轉化為木質素[18]。國外學者認為木質化與軟木質沉積物能夠充當細胞壁之間的防水隔離層，從而增強植物抵御低溫脅迫的能力[19]。本試驗中，葡萄品種赤霞珠、左優紅的枝條纖維素含量隨著溫度的降低呈現先上升、后下降的變化趨勢；但木質素含量卻呈現不同的變化。植物的抗寒性是由許多數量或質量遺傳基因綜合作用累加的結果，每一個與抗寒性有關的性狀對木本植物的抗寒性都起一定的作用[16]。有研究表明，纖維素的合成與SOD、POD活性存在一定的相關性[20]，試驗也證明了這一點，纖維素的含量與SOD活性變化趨勢基本一致。在低溫脅迫環境下部分酶會出現響應，比如木質素代謝途徑[21]（咖啡酸3-O-甲基）出現變化，由此可以推斷纖維素與木質素的合成會受到低溫的影響。但木質素的合成是植物體內比較復雜的生化過程，存在多基因、多條代謝途徑交互作用的結果，其中不乏抗寒基因表達途徑的關聯部分。

GSH（谷胱甘肽）作為一種重要的抗氧化劑，能夠清除生物體內的自由基，從而減緩植物在逆境脅迫中所受到的傷害。而GSH-Px的作用就是將GSH轉化為GSSG（GSH的氧化形態）。從試驗結果可以看出，低溫脅迫能明顯誘導GSH-Px的活性，低溫處理與對照相比，前者的GSH-Px活性明顯高于后者。Logan等[19]將GR基因轉入棉花（Gossypium hirsutum L.）內，在室內模擬條件下將溫度由28 ℃降至14 ℃，使轉基因棉花的GSH活性比野生型棉花高30～40倍，表明轉基因棉花的抗逆境脅迫能力得到提高。康國章等[18]在自然低溫環境下對小麥（Triticum aestivum L.）葉片的抗凍生理指標進行測定，得出了GSH在葉片中只是一種應激性物質，并不宜作為評價植株受凍程度的指標。目前，雖然認為GSH-Px在植物的逆境生理中發揮著很重要的作用，但仍存在爭議。一種觀點認為GSH-Px活性在逆境脅迫過程中的變化反映的是作物對逆境脅迫的積極適應性調節過程；另一種觀點認為這種表現只是一種被動的受害癥狀。本研究初步探尋了低溫脅迫與GSH-Px的關系，得到了它們之間的一些規律，但其內部作用機理還不很明晰，還需進一步研究。

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