PPARγ轉(zhuǎn)錄阻遏NF-κβ通路抗體外循環(huán)肺損傷的影響及作用機(jī)制

楊 威 張小強(qiáng) 董 嘯

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，江西 南昌 330008

體外循環(huán)心臟手術(shù)為外科常用治療方法，由于手術(shù)過(guò)程常合并全身炎癥反應(yīng)和缺血再灌注損傷，往往引起肺功能下降，對(duì)術(shù)后患者疾病康復(fù)產(chǎn)生不利影響［1］。目前，關(guān)于體外循環(huán)肺保護(hù)的研究越來(lái)越受到關(guān)注，相關(guān)機(jī)制涉及白細(xì)胞反應(yīng)、補(bǔ)體激活、氧自由基過(guò)量產(chǎn)生、細(xì)胞因子作用等［2］。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARs)為核激素受體超家族成員。研究表明，PPARγ參與機(jī)體多種生理反應(yīng)調(diào)節(jié)，尤其對(duì)炎性反應(yīng)發(fā)揮了廣泛的調(diào)節(jié)作用，如降低活化氧釋放、減少細(xì)胞因子以及影響細(xì)胞的增殖分化和凋亡［3］。然而，關(guān)于PPARY在體外循環(huán) (CPB)術(shù)后肺損傷過(guò)程中如何變化鮮見報(bào)道。研究采取常規(guī)體循環(huán)肺損傷模型，以分析PPARγ在體外循環(huán)肺損傷中的作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組 動(dòng)物為成熟雄性昆明種大鼠，體外循環(huán)肺損傷大鼠模型由南昌大學(xué)心血管病研究所提供，體重250～300g。根據(jù)干預(yù)方式不同進(jìn)行動(dòng)物分組:對(duì)照組，大鼠只進(jìn)行麻醉和CPB插管，不進(jìn)行CPB轉(zhuǎn)流;模型組:大鼠進(jìn)行30min深低溫停循環(huán);干預(yù)組:大鼠經(jīng)舌下靜脈注射0.3mg/kg PPAR-γ選擇性激動(dòng)劑羅格列酮 (ROSI)30 min后，進(jìn)行30min深低溫停循環(huán);以上每組動(dòng)物10只。

1.2 組織標(biāo)本采集 大鼠處死后取右肺固定于4%甲醛溶液中，梯度蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，切片，片厚為4μm;組織經(jīng)脫蠟后，進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)病理變化;取左肺分放于凍存管中，置于-80℃保存，以備下一步實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.3 Western blotting檢測(cè) 取出-80℃保存的左肺組織，提取組織總蛋白，蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳分離，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，封閉，再進(jìn)行一抗、二抗處理，室溫脫色搖床避光處理1h，洗膜，熒光系統(tǒng)掃描，應(yīng)用β-actin作內(nèi)參，記錄每個(gè)條帶灰度積分值;采取NIH Image圖像軟件分析各指標(biāo)平均吸光度值 (average absorbance，AA)，對(duì)樣品積分值/內(nèi)參照積分值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理;檢測(cè)包括PPAR-γ、NF-κβp65表達(dá)。

1.4 Elisa檢測(cè) 各組動(dòng)物于造模后4h取外周血約5ml，3000r/min離心10min，儲(chǔ)于-80℃ 保存?zhèn)錅y(cè)，或直接在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)有D-二聚體和熱休克蛋白70(HSP70)，試劑盒由北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ和 NF-κβp65蛋白表達(dá)比較 由表1可知，與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物PPARγ表達(dá)有所增加，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，而NF-κβp65表達(dá)明顯升高 (P＜0.01);ROSI預(yù)處理后，動(dòng)物PPARγ表達(dá)較模型組明顯升高，而NF-κβp65表達(dá)明顯降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。

表1 ROSI預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)肺損傷大鼠中PPARγ和NF-Bp65蛋白表達(dá)的影響 (±s)

表1 ROSI預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)肺損傷大鼠中PPARγ和NF-Bp65蛋白表達(dá)的影響 (±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 PPARγ(灰度值) NF-κβp65(灰度值)對(duì)照組10 88.05±8.92 109.33±11.03模型組 10 89.72±8.67 262.51±26.85*干預(yù)組 10 119.21±7.87# 102.34±10.92#

2.2 D-二聚體和HSP70水平比較 由表2可知，與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物血清D-二聚體水平明顯升高，而HSP70明顯降低 (P＜0.01);ROSI預(yù)處理后，動(dòng)物血清D-二聚體水平較模型組明顯降低，而HSP70明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。

表2 ROSI預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)肺損傷大鼠血清D-二聚體和HSP70表達(dá)的影響 (±s)

表2 ROSI預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)肺損傷大鼠血清D-二聚體和HSP70表達(dá)的影響 (±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與干預(yù)組比較，#P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 D-二聚體 (mg/l) HSP70(ng/ml)對(duì)照組10 0.55±0.07 394.62±40.71模型組 10 2.79±0.28* 155.27±16.49*干預(yù)組 10 0.62±0.09# 386.55±39.75#

3 討論

CPB技術(shù)為心臟外科心內(nèi)直視手術(shù)開展的必需條件，故CPB術(shù)后必須面對(duì)肺功能損傷的并發(fā)癥，而如何預(yù)防和治療成為當(dāng)前心外科急需解決的重要難題［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，肺缺血再灌注損傷和全身炎癥反應(yīng)是CPB術(shù)后肺損傷的主要發(fā)生機(jī)制，該發(fā)現(xiàn)使并發(fā)癥的預(yù)防和治療得到明顯進(jìn)步［6］。關(guān)于CPB術(shù)后肺損傷的分子機(jī)制的研究有利于新的治療方案以及防治藥物的開發(fā)，從而減少CPB術(shù)后肺功能損傷的發(fā)生。

PPARγ作為依賴配體活化轉(zhuǎn)錄因子的一種，也是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn);PPAR-γ可結(jié)合于多種核轉(zhuǎn)錄因子以及胞質(zhì)輔助蛋白，通過(guò)反式抑制作用，調(diào)節(jié)炎介質(zhì)合成和抗炎介質(zhì)產(chǎn)生，是維持細(xì)胞抗炎和促炎過(guò)程動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)點(diǎn)［7］。PPAR-γ由配體激活后對(duì)炎癥性疾病引起的炎癥反應(yīng)起抑制作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κβ參與多種炎癥反應(yīng)過(guò)程，可釋放多炎性介質(zhì)，是細(xì)胞核內(nèi)炎性介質(zhì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)開關(guān)［9］。CPB術(shù)后肺功能損傷過(guò)程中炎癥反應(yīng)是主要的危害物質(zhì)，且NF-κβ是多種疾病過(guò)程中肺損傷調(diào)節(jié)的重要因素［10］。因此，PPAR-γ激動(dòng)劑可能經(jīng)抗炎途徑發(fā)揮保護(hù)肺損傷的作用。PPAR-γ對(duì)NF-κβ抑制作用明顯，具體途徑多條，如可直接結(jié)合NF-κβ亞基p65/p50，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，降低NF-κβ與DNA結(jié)合活性，抑制NF-κβDNA合成，從而抑制其表達(dá)［11］。研究顯示，模型組動(dòng)物NF-κβp65表達(dá)明顯升高;而采取PPAR-γ激動(dòng)劑ROSI預(yù)處理后，動(dòng)物PPARγ表達(dá)較模型組明顯升高，而NF-κβp65表達(dá)明顯降低，表明PPAR-γ被活化后，可能通過(guò)抑制NF-κβ途徑發(fā)揮對(duì)CPB術(shù)后肺損傷的保護(hù)作用。

研究證實(shí)，HSP70參與了PPAR-γ配體激活、對(duì)肺損傷有保護(hù)作用，且HSP70的抗炎作用與其減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子水平、尤其是抑制NF-κB活性密切相關(guān)［12］。D-二聚體作為交聯(lián)纖維蛋白的最終降解產(chǎn)物，是凝血與纖溶功能的重要分子標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，多種疾病引起的肺損傷過(guò)程中，D-二聚體呈現(xiàn)高水平狀體，且D-二聚體與肺功能呈負(fù)相關(guān)［13］。研究結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物較對(duì)照組血清D-二聚體水平明顯升高，而HSP70明顯降低;ROSI預(yù)處理后，動(dòng)物血清D-二聚體水平明顯降低，而HSP70明顯升高 (P＜0.01)。證實(shí)了PPAR-γ激動(dòng)劑ROSI預(yù)處理可引起機(jī)體D-二聚體水平降低［14］。

綜上所述，PPARγ轉(zhuǎn)錄在CPB術(shù)后體外循環(huán)肺損傷中起到保護(hù)作用，其阻遏NF-κβ通路以及通過(guò)影響血清D-二聚體和HSP70水平可能在其中發(fā)揮了重要作用，值得進(jìn)一步探究。

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