提高卷曲霉素的發酵質量

方媛 楊森 張昭

摘 要：硫酸卷曲霉素生產使用纏繞鏈霉菌，是多肽類結構的二線抗結核新型藥物；在此次研究過程中，菌種分別采用紫外線誘變法和快中子輻射進行了菌種選預，經過菌種選育，使得發酵單位增長了10%以上；并且為了提高原液的質量，增加產品的品質，我們通過對過濾工藝的更新，將發酵液酸化pH值和過濾溫度控制工藝優化試驗，成功的減少了CAⅠ前雜質的產生。

關鍵詞：卷曲霉素；菌種選育；過濾優化

卷曲霉素主要用于治療結核病，結核病高發帶在落后地區和貧困人群，提高技術指標、降低生產成本，不僅能給公司帶來經濟效益，也能帶來良好的社會效益。發酵單位高低是影響卷曲霉素生產成本的主要因素之一，而菌種的不穩定性是造成發酵水平較低的主要原因。優良菌株的選育能大幅提高菌株產生有利用價值代謝產物的水平，還可以改進產品質量；是生產水平不斷提高，使抗生素工業迅速發展的關鍵之一。由此我們將加大育種的力度并進行工藝優化，提高生產指標，降低成本。并且卷曲霉素原液中相關單雜的增加會直接影響卷曲霉素成品中有效組分的含量，降低產品的等級，影響銷售價格，減少產品利潤。為了不斷提高產品質量，樹立良好的企業形象，增加企業利潤，滿足客戶對產品質量標準日益提高的要求，我們把提高原液質量作為發酵工段產品質量提高研究的重點。針對相關雜質主要為蛋白類物質的物化性質和產生原因，我們通過發酵液酸化pH值和過濾溫度控制工藝優化試驗，總結出兩者與產品中雜質含量的關系。

1材料與方法

1.1菌種

纏繞鏈霉菌由華北制藥華勝公司提供。

1.2 工藝簡介

硫酸卷曲霉素發酵過程是以葡萄糖、淀粉、魚粉、磷酸鹽為主要碳、氮、磷源的液體培養基中，在27.5～32.5℃進行通氣攪拌培養，經三級發酵生物合成卷曲霉素。發酵過程結束后，發酵液用草酸酸化、加熱，過濾除去大量不溶性菌絲體、堿性蛋白、鈣鎂離子、培養基殘渣等雜質。再用液體氫氧化鈉中和。成為符合離子交換工藝要求的硫酸卷曲霉素原液。

1.3 高產菌株的誘變和選育

誘變育種是提高發酵水平的重要手段之一。其中，紫外線誘變法是微生物育種中最常用和比較有效的誘變法。快中子誘變法，具有較大的電離密度，能更多地引起點突變和染色體畸變，已有較多在抗生素產生菌的誘變育種中獲得了明顯效果的報道。我們利用經紫外線誘變后的高產突變株為出發菌株，快中子輻射后進行二次篩選。其誘變致死率和營養缺陷的誘發率均比單一誘變的要高。從中篩選出高產菌株JQ1001、JQ100B和JQ10-05，其搖瓶效價較出發菌株提高了15%左右，新菌株投入發酵生產使用后，較2014年年平均增長8.2%，并且具有良好的遺傳穩定性。

表1 高產突變株穩定性實驗

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][傳代數

F1

F2

F3

F4

F5][JQ10-02

100.0

100.5

98.9

99.2

97.5][JQ1001

112.1

110.0

111.3

109.8

107.9][JQ100B

109.7

112.4

109.9

108.5

108.3][JQ10-05

110.3

110.8

110.7

108.6

108.6]

注：搖瓶效價相對出發菌株F1代按100.0計算。

如表格所示，該菌種具有良好的遺傳穩定性；菌種工藝在經過優化之后，篩選出來高單位菌株，其菌株搖瓶效價平均達到10000 u/ml以上。相應卷曲霉素的發酵單位有了顯著提高，新菌種應用的發酵罐批次，平均發酵單位要比原菌種提高8.2%。成功的降低了卷曲霉素的生產成本。

1.4 革新過濾工藝，提高原液質量

卷曲霉素過濾的工藝為：發酵結束后發酵液用草酸將pH調制酸性，然后加入助濾劑，用蒸汽加熱至90℃。經板框過濾機過濾，酸性濾液冷卻后用液體氫氧化鈉溶液調pH至堿性。取樣檢驗合格后交提取工序。但是由于原先工藝比較粗狂，導致原液的雜質含量一直較高，為此，針對相關雜質主要為蛋白類物質的物化性質和產生原因，我們通過發酵液酸化pH值和過濾溫度控制工藝優化試驗，總結出兩者與產品中雜質含量的關系。如下表：

表2 加熱時間對過濾前原液的CAⅠ前雜質的影響

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][加熱時間/h

CAⅠ前雜質/%][2

0.01][3

0.05][4

0.10][5

0.23][6

0.39][7

0.50][8

0.78]

表3 pH值對過濾時間以及原液的CAⅠ前雜質的影響

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][pH值

過濾時間/h

CAⅠ前雜質/%][2.0

3

0.40][2.5

2

0.03][3.0

3

0.43][3.5

5

0.56][4.0

5

0.55][4.5

8

0.79][5.0

10

1.32]

由此可見，加熱時間越短，過濾前原液的CAⅠ前雜質的產生就越低，過濾時間越短，其CAⅠ前雜質的產生就越低，針對這個情況，一方面我們把發酵液酸化pH值控制在2.5左右，提高了過濾速度；另一方面我們對過濾設備進行改造，在濾前罐與板框之間增加了一個管道加熱器和維持罐，把加熱的時間由原來的3～5小時減少到了2個小時，減少了CAⅠ前雜質的產生，新工藝實施后，雖然增加了工作量，但是原液中雜質含量明顯降低，質量得到明顯提高，CAⅠ前雜質含量均低于工藝要求的0.5%CAⅠ前雜質的產生百分含量，其中有30批次的罐原液CAI前雜質為0，占到總原液罐數的77.8%，成品分子質量合格率為100%，成品分子生物效價比2013年提高了10.2個百分點，在2014年鞏固期，只有1罐原液CAI前雜質為0.3%，其余原液CAI前雜質均為0，原液質量得到進一步提升，成品分子質量也全部合格。

2 結論

①通過紫外線和快中子誘變法篩選后，從中篩選出高產菌株JQ1001、JQ100B和JQ10-05，其搖瓶效價較出發菌株提高了15%左右，新菌株投入發酵生產使用后，較2014年平均增長8.2%。并且具有良好的遺傳穩定性。

②優化了現有的過濾工藝，確定了發酵液酸化pH值、對過濾設備進行了改造，優化了過濾溫度控制工藝，降低了原液中雜質的含量，提高了原液質量。

參考文獻：

[1]耿予歡，李國基，姚汝華，等.鏈霉素發酵的代謝調控育種及研究進展[J].現代食品科技，文章篇號：1007-2764（2006）04-0244-082.

作者簡介：方媛，女，漢，河北保定人，供職于華北制藥股份有限公司新制劑分廠，學士學位，研究方向：生物技術。