甜菜堿調控RhoA/ROCK信號通路抑制大鼠急性心肌缺血損傷

袁婭妮， 毛福英， 劉俊梅， 買淑霞， 王 洋， 戴貴東， 鄭 萍，4*

（1.寧夏醫科大學藥學院藥理學系，寧夏　銀川　750004；2.銀川市口腔醫院，寧夏　銀川　750004；3.凱里學院化學與材料工程學院制藥工程教研室，貴州　凱里　556011；4.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏　銀川　750004）

甜菜堿調控RhoA/ROCK信號通路抑制大鼠急性心肌缺血損傷

袁婭妮1， 毛福英1， 劉俊梅1， 買淑霞1， 王 洋2， 戴貴東3， 鄭 萍1，4*

（1.寧夏醫科大學藥學院藥理學系，寧夏銀川750004；2.銀川市口腔醫院，寧夏銀川750004；3.凱里學院化學與材料工程學院制藥工程教研室，貴州凱里556011；4.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏銀川750004）

目的 探討從枸杞中分離得到的甜菜堿對異丙腎上腺素（ISO）誘導的大鼠急性心肌缺血損傷的保護作用機制。方法 大鼠分別灌胃給予不同劑量甜菜堿（100、200和400 mg/kg）共40 d，于第39天和第40天皮下注射ISO 85 mg/（kg·d）誘發大鼠急性心肌缺血。取大鼠心肌組織進行病理學觀察，ELISA法測定血清TGF-β1與ET-1的水平，并采用Western-blot法測定相關蛋白的表達。結果 與模型組比較，甜菜堿（100、200和400 mg/kg）明顯改善心肌組織壞死，炎細胞浸潤及間質水腫。甜菜堿（100、200、400 mg/kg）可明顯降低血清TGF-β1及ET-1的水平（P＜0.01），抑制心肌組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達的升高（P＜0.01）。結論 甜菜堿可通過調控RhoA/ROCK信號通路保護ISO誘導的大鼠急性心肌缺血損傷。

甜菜堿；異丙腎上腺素；急性心肌缺血；TGF-β1；ET-1；RhoA/ROCK信號通路

甜菜堿（betaine）是從寧夏藥食兩用回藥材中寧枸杞Lycium barbarum L.中分離得到的，化學名為三甲基甘氨酸，結構與氨基酸、膽堿類似，屬于季胺堿類物質。甜菜堿具有保護肝臟、緩和應激、鎮靜、抗腫瘤等藥理作用［1］。研究表明，甜菜堿具有抗氧化作用，可抑制異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）致大鼠急性心肌缺血［2］。急性心肌缺血可引發急性心絞痛和急性心肌梗死，嚴重威脅人類生命健康。心肌缺血的發病機制與RhoA/ ROCK信號通路密切相關，已成為近年來研究的熱點［3］。有文獻報道，ISO誘導的大鼠急性心肌缺血可激活RhoA/ROCK信號通路，增加RhoA和ROCK蛋白的表達［4-6］。本實驗旨在以ISO誘導的大鼠急性心肌缺血為模型，重點考察甜菜堿對大鼠心肌組織RhoA/ROCK信號通路的影響，闡明甜菜堿對急性心肌缺血的作用機制。為其進一步的開發與應用提供科學依據。

1　材料

1.1實驗動物 清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量100～120 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SYXK（寧）2013-0001。

1.2藥品與試劑 甜菜堿購自Aesar Johnson Mathey公司，純度＞99.0%，（批號C8435A），用生理鹽水溶解配制成1%、2%和4%的甜菜堿溶液待用；異丙腎上腺素購自上海梯西愛有限公司，純度＞99.0%；0.9%氯化鈉注射液購自廣西裕源藥業有限公司；TGF-β1及ET-1酶聯免疫反應檢測試劑購自武漢華美試劑有限公司；凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；RhoA、ROCK1及ROCK2一抗購自Abcam公司，山羊抗小鼠，山羊抗兔二抗及小鼠抗β-actin抗體均購自北京中杉金橋生物技術公司；實驗用水為超純水。

1.3儀器 TY96-ⅡN型超生細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850R型臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Mutiskan Go酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國BIO-RAD公司）；培清JS-860B凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

2　方法

2.1急性心肌缺血模型的建立 72只清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為6組：正常對照組、ISO組、ISO+甜菜堿（100、200和400 mg/kg）組、單用甜菜堿（400mg/kg）組，每組12只。甜菜堿分別按400、200、100 mg/kg灌胃給藥，共40 d，正常對照組和ISO組灌胃給予等體積生理鹽水。第39天和第40天ISO組和ISO+甜菜堿（100、200和400 mg/kg）組于灌胃1 h后皮下注射給予ISO 85 mg/（kg·d）建立大鼠急性心肌缺血模型，每日1次，連續2 d，正常對照組和單用甜菜堿組大鼠皮下注射相應體積生理鹽水。末次給藥24 h后，大鼠股動脈放血，收集血液并在室溫下靜置1 h，6 000×g離心10 min，-20℃冰箱中凍存；取部分心臟組織用4%多聚甲醛固定，其余部分經液氮凍存后置-80℃冰箱中保存備用。

2.2病理學組織觀察 4%多聚甲醛固定的心肌組織用流水沖洗以去除留在組織內的固定液，然后梯度乙醇脫水、常規石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅（HE）染色處理，光鏡下觀察心肌細胞及心肌間質的變化。

2.3血清TGF-β1和ET-1的測定 取-20℃保存

3　結果

3.1心肌組織的形態學變化 光鏡下結果顯示，正常對照組和單用甜菜堿組大鼠橫紋清晰，心肌細胞排列整齊，著色均勻。ISO組大鼠部分區域心肌細胞壞死，橫紋不齊或消失，有炎性因子滲出，并伴有間質水腫。ISO+甜菜堿（100、200和400 mg/kg）依次減輕大鼠心肌缺血損傷程度，改善ISO引起的心肌組織形態學改變，見圖1。

3.2血清TGF-β1與ET-1水平 與正常對照組比較，ISO組大鼠血清中TGF-β1與ET-1水平明顯升高（P＜0.01）。與ISO組比較，ISO+甜菜堿（100、200和400 mg/kg）能顯著抑制TGF-β1和ET-1的分泌（P＜0.01）。單用甜菜堿（400 mg/kg）對正常大鼠血清TGF-β1與ET-1水平沒有影響，見表1。

3.3心肌組織RhoA、ROCK1和ROCK2的表達Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，ISO組RhoA、ROCK1和ROCK2的表達明顯增加（P＜0.01）。ISO+甜菜堿（100、200和400 mg/kg）可顯著抑制ISO致RhoA、ROCK1和 ROCK2蛋白表達的增加（P＜0.01）。單用甜菜堿（400 mg/kg）對正常心肌組織蛋白表達無影響，見圖2～圖4。的大鼠血清。分別按TGF-β1和ET-1酶聯免疫試劑盒說明書進行操作。

2.4Western blot檢測 取約50 mg心肌組織，經液氮研磨，加入0.4 mL冷裂解緩沖液，冰浴下超聲破碎細胞。于4℃，6 953×g離心10min，取上清蛋白定量，剩余上清加入上樣緩沖液于100℃水浴10 min，-20℃保存。取蛋白樣本60μg上樣，（7.5%或10%）SDS-PAGE凝膠電泳（80 V/120 V電壓）進行分離，200 mA恒定電流將蛋白轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別用抗RhoA抗體（1∶2 000）、抗ROCK1抗體（1∶500）、抗ROCK2抗體（1∶1 000）及抗β-actin抗體（內參，1∶1 000），4℃孵育過夜。分別加入山羊抗兔（偶聯有辣根過氧化物酶，1∶3 000）和山羊抗小鼠二抗（偶聯有辣根過氧化物酶，1∶5 000）常溫孵育2 h，加入超級化學發光底物反應液，曝光膠片。膠片掃描結果采用Quantity-one軟件分析，將目的條帶的光密度值與其相對應的內參β-actin的光密度值相比以校正誤差，所得比值代表該目的蛋白的相對含有量。

圖1　甜菜堿對ISO誘導的急性心肌缺血損傷大鼠病理組織變化的影響（HE，200×）Fig.1 Effects of betaine on cardiac histopathological changes of ISO-induced acute myocardial ischem ic injury in rats（HE 200×）

表1　甜菜堿對ISO誘導心肌缺血損傷大鼠血清內皮素和生長轉化因子的影響（±s，n=8）Tab.1 Effects of betaine on serum levels of endothelin-1（ET-1）and transform ing grow th factor-β1（TGF-β1）in ISO-induced m yocardial injury rats（±s，n=8）

表1　甜菜堿對ISO誘導心肌缺血損傷大鼠血清內皮素和生長轉化因子的影響（±s，n=8）Tab.1 Effects of betaine on serum levels of endothelin-1（ET-1）and transform ing grow th factor-β1（TGF-β1）in ISO-induced m yocardial injury rats（±s，n=8）

注：與正常對照組相比，**P＜0.01；與ISO組相比，##P＜0.01

組別ET-1/（pg·mL-1）TGF-β1/（pg·mL-1）正常對照組25.03±2.49 30.56±1.44甜菜堿400 mg/kg組23.88±1.97 32.53±3.55 ISO 85 mg/kg組63.72±3.02**73.08±4.60**甜菜堿100 mg/kg+ISO組42.68±4.08##53.62±3.84##甜菜堿200 mg/kg+ISO組36.28±2.81##46.36±3.38##甜菜堿400 mg/kg+ISO組25.08±3.02##32.15±3.10##

4　討論

甜菜堿是一種季胺類生物堿，可以作為甲基供體降低血漿同型半胱氨酸的水平而抑制心血管疾病發生，甜菜堿具有治療高同型半胱氨酸血癥，抗動脈粥樣硬化，保護心肌缺血損傷的作用［2，7］。早在1999年，Mar等人研究表明，法國商業用酒中加入一定量的甜菜堿，有利于脂肪降解，并能夠抑制缺血性心臟病的發作［8］。心肌缺血（myocardial ischemia）的本質是由于心臟供氧與需氧的不平衡所造成的。ISO能激動心臟β1受體，使心肌興奮性提高，收縮和心率加快，代謝增強，增加心肌耗氧量，此外，它也能激動β2受體，使外周血管擴張，回心血量減少，動脈壓下降，冠脈血流量減少［9］。本實驗采用皮下注射ISO（85 mg/kg）建立大鼠急性心肌缺血模型，病理結果顯示，ISO組大鼠心肌細胞壞死甚至融合成片狀，伴有間質水腫和炎細胞浸潤，與文獻報道結果一致［10］，甜菜堿（100、200和400 mg/kg）能明顯改善ISO誘導的急性心肌缺血大鼠心肌組織形態學改變，減輕心肌病理損傷。提示，甜菜堿對大鼠急性心肌缺血具有保護作用。

圖2　甜菜堿對ISO誘導的急性心肌缺血大鼠心肌組織RhoA表達的影響（±s，n=8）Fig.2 Effects of betaine on expression of RhoA in hearts from ISO-induced myocardial ischem ic rats（±s，n=8）

RhoA是一種小分子GTP結合蛋白，RhoA的下游效應蛋白ROCK，又稱Rho激酶，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調節許多基礎的細胞功能如遷移、收縮、黏附等，ROCK有兩個亞型，ROCK1（ROCKβ）和ROCK2（ROCKα），二者在體內廣泛表達，前者主要在肝、肺、脾、腎中表達，后者主要在大腦和骨骼肌中表達，兩者均在心臟和血管平滑肌表達［11］。其過度表達與高血壓、心肌肥厚、心衰等心血管病的發生密切相關［12］。有文獻報道，在ISO誘導的大鼠急性心肌缺血中，RhoA/ROCK信號通路蛋白表達增加，黃連堿預防給藥可以降低RhoA及ROCK蛋白的表達，保護缺血的心肌組織［6］。臨床和實驗研究表明，ROCK抑制劑Y-27632和法舒地爾抑制RhoA/ROCK信號途徑后，可減輕心肌缺血［3，13］。本實驗結果顯示，ISO可誘導大鼠心肌組織RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達增加，預先給予甜菜堿（100、200和400 mg/kg）后，心肌組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達均顯著降低。提示，甜菜堿對ISO誘導的急性心肌缺血損傷保護作用的機制與抑制RhoA/ ROCK信號通路有關。

圖4　甜菜堿對ISO誘導的急性心肌缺血大鼠心肌組織ROCK 2表達的影響（±s，n=7）Fig.4 Effects of betaine on the expression of ROCK2 in hearts from ISO-induced myocardial ischem ic rats（±s，n=7）

此外，研究表明，心肌缺血時，損傷的心肌細胞會釋放細胞因子如TGF-β、ET-1等，RhoA/ ROCK信號通路可被TGF-β、ET-1等細胞因子激活［14-16］。本實驗結果顯示，ISO可誘導大鼠血清TGF-β1和ET-1水平升高，甜菜堿（100、200和400 mg/kg）預防給藥后，血清TGF-β1和ET-1水平明顯下降。

綜上所述，甜菜堿對ISO誘導的大鼠急性心肌缺血損傷具有保護作用，其機制可能與抑制TGF-β1和ET-1釋放，調控RhoA/ROCK信號通路有關。

［1］ Ganesan B，Anandan R.Protective effect of betaine on changes in the levels of lysosomal enzyme activities in heart tissue in isoprenaline-induced myocardial infarction in Wistar rats［J］.Cell Stress Chaperones，2009，14（6）：661-667.

［2］ Ganesan B，Buddhan S，Anandan R，et al.Antioxidant defense of betaine against isoprenaline-induced myocardial infarction in rats［J］.Mol Biol Rep，2010，37（3）：1319-1327.

［3］ Cadete V J，Sawicka J，Polewicz D，et al.Effect of the Rho kinase inhibitor Y-27632 on the proteome ofheartswith ischemia-reperfusion injury［J］.Proteomics，2010，10（24）：4377-4385.

［4］ Zhu J，Nguyen D，Ouyang H，et al.Inhibition of RhoA/Rhokinase pathway suppresses the expression of extra cellularmatrix induced by CTGF or TGF-βin ARPE-19［J］.Int J Ophthalmol，2013，6（1）：8-14.

［5］ Hamid S A，Bower H S，Baxter G F.Rho kinase activation plays amajor role as amediator of irreversible injury in reperfused myocardium［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2007，292（6）：2598-2606.

［6］ Gong L L，Fang LH，Wang SB，etal.Coptisine exert cardioprotective effect through anti-oxidative and inhibition of RhoA/ Rho kinase pathway on isoproterenol-induced myocardial infarction in rats［J］.Atherosclerosis，2012，222（1）：50-58.

［7］ 李炳龍，齊永秀，劉常麗，等.甜菜堿藥理作用機制及其藥效學研究進展［J］.中國新藥雜志，2008，17（18）：1571-1574.

［8］ Mar M H，Zeisel SH.Betaine in wine：answer to the paradox？［J］.Med Hypotheses，1999，53（5）：383-385.

［9］ 盧智強，張艷軍，崔廣智，等.心肌缺血模型的制作方法研究進展［J］.中國藥理學通報，2012，28（8）：1053-1057.

［10］ Song F，LiH，Sun J，et al.Protective effects of cinnamic acid and cinnamic aldehyde on isoproterenol-induced acutemyocardial ischemia in rats［J］.J Ethnopharmacol，2013，150（1）：125-130.

［11］ Dong M，Yan B P，Yu C M.Current status of Rho-associated kinases（ROCKs）in coronary atherosclerosis and vasospasm［J］.Cardioυasc Hematol Agents Med Chem，2009，7（4）：322-330.

［12］ Surma M，Wei L，Shi J.Rho kinase as a therapeutic target in cardiovascular disease［J］.Future Cardiol，2011，7（5）：657-671.

［13］ Mohri M，Shimokawa H，Hirakawa Y.Rho-kinase inhibition with intracoronary fasudil prevents myocardial ischemia in patients with coronarymicrovascular spasm［J］.JAm Coll Cardiol，2003，41（1）：15-19.

［14］ Walsh SK，Kane K A，Wainwright C L.Mast cell degranulation-amechanism for the anti-arrhythmic effect of endothelin-1？［J］.Br JPharmacol，2009，157（5）：716-723.

［15］ Ma S，Ma CC.Recentdevelopment in pleiotropic effectsof statins on cardiovascular disease through regulation of transforming growth factor-beta superfamily［J］.Cytokine Growth Factor Reυ，2011，22（3）：167-175.

［16］ BaoW，Hu E，Tao L，et al.Inhibition of Rho-kinase protects the heart against ischemia/reperfusion injury［J］.Cardioυasc Res，2004，61（3）：548-558.

Betaine protects against isoproterenol-induced acutem yocardial ischem ic injury through the regulation of RhoA/ROCK pathway

YUAN Ya-ni1， MAO Fu-ying1， LIU Jun-mei1， MAIShu-xia1， WANG Yang2， DAIGui-dong3，ZHENG Ping1，4*
（1.School of Pharmacy，Ningxia Medical Uniυersity，Yinchuan 750004，China；2.Yinchuan Stamotology Hospital，Yinchuan 750004，China；3.Department of Pharmaceutical Engineering，School of Chemical and Materials Engineering，KailiUniυersity，Kaili556011，China；4.Ningxia Engineering &Technology Research Center for Modernization of HuiMedicine，Yinchuan 750004，China）

AIM To investigate the cardioprotective effects of betaine extracted from Lycium barbarum L.onregulation of RhoA/ROCK pathway in isoproterenol-induced acute myocardial ischemia.METHODS Betaine（100，200 and 400 mg/kg）was administered orally once a day for forty days，and acutemyocardial injury was induced by subcutaneous injection of isoproterenol（85 mg/kg）in rats on the 39th and 40th day.Myocardial injury was examined by histopathological evaluation.Serum levels of transforming growth factor（TGF）-β1 and endothelin（ET）-1 were analyzed by ELISA.In addition，the protein expression of RhoA、ROCK1and ROCK2 were measured byWestern-blot.RESULTS Oral administration of betaine（100，200 and 400 mg/kg）attenuatedmyocardial necrosis，interstitial edema，and inflammatory cell infiltration.Moreover，the treatment with betaine decreased isoproterenol-induced elevated serum levels of TGF-β1 and ET-1（P＜0.01）aswell as increased protein expression of RhoA，ROCK1 and ROCK2（P＜0.01）.CONCLUSION The present study has demonstrated that betaine protects against isoproterenol-induced myocardial ischemia via down-regulating RhoA/ROCK pathway.

betaine；isoproterenol；acute myocardial ischemic injury；TGF-β1；ET-1；RhoA/ROCK pathway

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0492-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.006

2014-05-04

國家自然科學基金資助項目（81160403）

袁婭妮（1990—），女，碩士生，研究方向為心血管藥理。E-mail：yuanyani222@163.com

鄭 萍（1973—），女，碩士，副教授，研究方向為心血管藥理。Tel：（0951）6980123，E-mail：zhengping2004@ 126.com

網絡出版日期：2014-09-23

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140923.1211.001.html