氫溴酸東莨菪堿溫敏型鼻用原位凝膠的制備

李美燕， 林 於， 歐陽雪， 鄭 欣

（重慶醫科大學，重慶　400016）

氫溴酸東莨菪堿溫敏型鼻用原位凝膠的制備

李美燕， 林 於*， 歐陽雪， 鄭 欣

（重慶醫科大學，重慶400016）

目的 制備氫溴酸東莨菪堿的溫敏型鼻用原位凝膠。方法 用不同質量濃度和配比的殼聚糖、β-甘油磷酸鈉制備不同pH的原位凝膠，并測定其凝膠化時間、黏度變化情況與載藥凝膠的累積釋放度。結果 質量濃度為2%的殼聚糖和56%的β-甘油磷酸鈉體積比為6∶1，pH 7.1時原位凝膠黏度達到5 Pa·s，初始凝膠溫度為34℃，隨著溫度的升高、殼聚糖質量濃度的增加、β-甘油磷酸鈉含量的增加、pH升高（由6.5升至7.2），凝膠化時間減少；以氫溴酸東莨菪堿為模型藥物，載藥凝膠中藥物10 h累積釋放度為71%，釋放曲線符合一級動力學方程。結論 殼聚糖/β-甘油磷酸鈉制備的氫溴酸東莨菪堿溫敏型原位凝膠對藥物具有緩釋作用，適合制成鼻用制劑。

殼聚糖；β-甘油磷酸鈉；溫敏型凝膠；氫溴酸東莨菪堿；緩釋

氫溴酸東莨菪堿作為抗膽堿藥，可用于阻斷副交感神經，常用于暈動病、抗震顫麻痹等的預防與治療［1-2］。目前常用的有片劑和普通貼膏劑等。氫溴酸東莨菪堿的T1-2非常短，常用普通片劑和貼膏劑不適合長途乘車或航海旅行，采用經皮緩釋給藥系統可在一定程度上減少反復給藥帶來的不良反應，改善藥物的順應性。

溫敏型原位凝膠是指以溶液狀態制備和給藥，在藥用部位因溫度變化刺激而發生相轉變，形成凝膠化半固體的制劑，因其良好的順應性和緩控釋能力以及生物利用度高等特點，近年來已成為藥劑學及生物材料領域的研究熱點［3-5］。得到廣泛研究和應用的凝膠材料殼聚糖（chitosan，CS），具有生物相容性、生物降解性、降解產物無毒等特點。有報道甘油磷酸鹽與殼聚糖的復合物在室溫、pH 6.8～7.2介質中可較長時間保持液態，升高溫度時可凝膠［6］，本研究采用殼聚糖/β-甘油磷酸鈉的混合體系，載入氫溴酸東莨菪堿，通過調節體系中殼聚糖的質量濃度、殼聚糖/β-甘油磷酸鈉配比，體系pH等得到了具溫敏性和緩釋效果的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉載氫溴酸東莨菪堿凝膠鼻腔給藥系統。

1　材料和方法

1.1材料 氫溴酸東莨菪堿（大連美侖生物技術有限公司）；殼聚糖（青島利中甲殼質公司）；β-甘油磷酸鈉（Ruibio，德國）；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1溫敏性鼻用原位凝膠的制備 準確稱量0.12 g的殼聚糖，加入6mL 0.1mol/L的鹽酸，磁力攪拌使之充分溶解；另取0.56 g的β-甘油磷酸鈉，溶于1 mL去離子水中，然后逐滴加入到殼聚糖混合溶液中，磁力攪拌30 min，混合均勻，以少量的0.02 mol/L的NaOH調節混合液的pH 7.1，得到空白凝膠溶液，加入氫溴酸東莨菪堿后得載藥凝膠溶液（Csh=0.06 g/mL）。

1.2.2溫敏性凝膠的凝膠溫度測定 取適量“1.2.1”項下空白凝膠溶液于燒杯中，置于水浴上，從25.0℃逐漸升溫到38.0℃，每升高1.0℃平衡20 min，用旋轉黏度計測定每個溫度下的黏度值，各重復操作3次，取平均值，然后作黏度隨溫度變化曲線，其中黏度值變化產生突躍時的溫度即為凝膠溫度。

1.2.3殼聚糖質量濃度對凝膠化時間的影響 按照“1.2.1”項下方法，配置殼聚糖質量濃度為0.5%、1%、1.5%與2%的空白凝膠溶液（β-甘油磷酸鈉用量不變）。用試管倒置法測凝膠化時間（GT）［7］，即將裝有2 mL上述空白凝膠溶液的試管直立置于34.0℃恒溫水浴中，每隔0.5 min將試管45°傾斜，并觀察液面是否隨試管傾斜，當觀察到液面不隨著試管呈45°而傾斜，則再恒溫0.5 min后，將試管取出并完全倒置，若0.5 min內試管內溶液不再流動，則定義該溶液己凝膠化，記錄該溫度下體系由液態轉為半固體所需時間，各重復操作3次，取平均值。

1.2.4殼聚糖/β-甘油磷酸鈉配比對凝膠化時間及凝膠黏度的影響 按照“1.2.1”項下方法，配制殼聚糖溶液和β-甘油磷酸鈉溶液，然后分別準確量取5、6、7 mL殼聚糖溶液于燒杯中，然后各逐滴加入1 mLβ-甘油磷酸鈉溶液，磁力攪拌30 min，混合均勻，以少量的0.02 mol/L的NaOH溶液調節混合液的pH 7.1。同上用試管倒置法測凝膠化時間（GT），各重復操作3次，取平均值；同法配制不同配比的混合液并測定其在34℃恒溫水浴中的黏度值，各重復操作3次，取平均值。

1.2.5體系pH對凝膠化時間的影響 按照“1.2.1”項下方法，制備不同pH的空白凝膠溶液。同上用試管倒置法測凝膠化時間，各重復操作3次，取平均值。

1.2.6溫度對凝膠化時間的影響 分別取適量“1.2.1”項下空白凝膠溶液置于25～38℃恒溫水浴中，同上用試管倒置法測凝膠化時間，各重復操作3次，取平均值。

1.2.7載藥凝膠的體外藥物釋放實驗 （1）人工鼻液的配置：精密稱取磷酸二氫鉀13.6 g，溶于適量去離子水中，攪拌使溶解，加去離子水至1 000 mL，攪勻，用0.1 mol/L氫氧化鈉調pH 6.8［8］。

（2）分別配制質量濃度為0.2～1.2 mg/mL的氫溴酸東莨菪堿對照品溶液，以人工鼻液為空白對照經紫外掃描，得到氫溴酸東莨菪堿的特征吸收波長為258 nm，空白凝膠溶液在258 nm處無吸收，在此波長下測其吸光度，繪制氫溴酸東莨菪堿質量濃度（C）-吸光度（A）標準曲線，進行線性回歸得到的擬合方程為：A=0.383 9 C+0.004 5（r2=0.999 2）。

（3）精密吸取載藥凝膠溶液2 mL，置截留相對分子質量為12 000的透析袋中，放入含人工鼻液150 mL的燒杯中，置于34℃水浴上，以200 r/min的速度攪拌，定時取樣2 mL，并及時補充2 mL人工鼻液，將各時間點的樣品溶液以人工鼻液為對照，于波長258 nm處測定其吸光度A，代入標準曲線方程求濃度，計算各時間點處載藥凝膠的累積釋放度（%）。同法測定氫溴酸東莨菪堿在相同條件下的累積釋放度（%）。

2　結果

2.1凝膠的凝膠溫度測定 在25～38℃內，殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溫敏性凝膠的黏度隨溫度的變化見圖1。在較低溫度下，凝膠溶液的黏度幾乎不隨溫度的變化而變化，而當溫度到達33℃時，體系的黏度開始隨溫度升高而增加，當溫度到達34℃后，體系黏度隨溫度升高而迅速增加，當溫度達到38℃時，體系已基本完全凝膠化。在較窄的溫度范圍內，凝膠黏度發生了較大的變化，說明該體系具有較顯著的溫敏特性。

圖1　殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溫敏性凝膠的黏度隨溫度的變化Fig.1 Temperature change on viscosity of tem peraturesensitive CS/β-GP gel

2.2殼聚糖質量濃度對凝膠化時間的影響 殼聚糖質量濃度對殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系在34℃下的凝膠化時間影響見圖2。隨著殼聚糖質量濃度由0.5%增加到2%，體系凝膠化時間由10 min減少至3.5 min，說明體系凝膠化時間隨殼聚糖質量濃度在一定范圍內的增加而減少。

2.3殼聚糖/β-甘油磷酸鈉配比對凝膠化時間及凝膠黏度的影響 殼聚糖/β-甘油磷酸鈉配比對殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系在34℃下的凝膠化時間及凝膠黏度的影響見圖3。隨著體系中β-甘油磷酸鈉相對含量在一定范圍內的增加，由殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體積比為7∶1變化到5∶1時，體系凝膠化時間由6 min減少至3 min，凝膠黏度也由2.2 Pa·s增加到6 Pa·s。當原位凝膠黏度達到5 Pa·s時，凝膠較稠，流動性較小，在鼻腔中黏附性較好，適合鼻腔給藥［9］。殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體積比為6∶1時凝膠化時間較短，凝膠黏度也符合要求，故選殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體積比6∶1作為凝膠體系的配比。

圖2　殼聚糖質量濃度對凝膠化時間的影響Fig.2 Effect of CS mass concentration on the gelation time

圖3　殼聚糖/β-甘油磷酸鈉配比對凝膠化時間及凝膠黏度的影響Fig.3 Effect of CS/β-GP ratio on the gelation time and the gel viscosity

2.4體系pH對凝膠化時間的影響 體系pH對殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系在34℃下的凝膠化時間影響見圖4。體系pH較低時，凝膠化時間較長，當pH值由6.5增加到7.1時，凝膠化時間由90 min減少至4 min，而當pH增加到7.2時，有殼聚糖沉淀析出。

2.5溫度對凝膠化時間的影響 溫度對殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系凝膠化時間影響見圖5。隨著溫度的升高，體系凝膠化的時間明顯減少。在4℃，25℃時，體系為可自由流動的液體狀態，60 min內沒有形成凝膠；而當溫度達到32℃之后，體系凝膠時間隨著溫度的升高而減少，34℃后可在4 min內快速凝膠化。

圖4　pH對凝膠化時間的影響Fig.4 Effect of pH value on the gelation time

圖5　溫度對凝膠化時間的影響Fig.5 Effect of tem perature on the gelation time

2.6載藥凝膠的累積釋放度測定 氫溴酸東莨菪堿原藥及載藥凝膠的累積釋放曲線見圖6。氫溴酸東莨菪堿原藥在1 h內累積釋放度為93%，2 h達到98%；載藥凝膠在釋放初期，藥物釋放速度較快，而后變得緩慢，10 h內累積釋放度為71%，之后釋放速度下降，曲線漸漸平坦。數據分別用零級動力學方程、一級動力學方程和Higuchi方程等數學模型擬合，以一級動力學方程擬合度最佳，r為0.991 5。

圖6　載藥凝膠的累積釋放度Fig.6 Cumulative release of the drug-loaded gel

3　討論

殼聚糖是一類帶正電荷的直鏈多糖，富含氨基和羥基，可形成氫鍵，在酸性溶液中殼聚糖上的堿性氨基能夠質子化，使殼聚糖分子鏈間帶同種電荷而相互排斥。β-甘油磷酸鈉為弱堿性化合物，結構中存在羥基和磷酸根負離子。由殼聚糖和β-甘油磷酸鈉的分子結構可知，二者在水溶液中主要存在3類相互作用［10-12］：一是靜電作用，如殼聚糖鏈間的靜電斥力、殼聚糖的氨基與β-甘油磷酸鈉的磷酸根間的靜電引力等；二是氫鍵作用，如殼聚糖鏈間的氫鍵、殼聚糖鏈與水之間的氫鍵作用以及β-甘油磷酸鈉的甘油部分與水之間的氫鍵作用等；三是殼聚糖鏈間的疏水作用。

殼聚糖溶解在酸性溶液中，當加入β-甘油磷酸鈉后，由于β-甘油磷酸鈉的弱堿性，使氨基去質子化，殼聚糖鏈間的靜電斥力減小，殼聚糖鏈間作用力增強；同時殼聚糖與β-甘油磷酸鈉間也有靜電作用，但在室溫時由于殼聚糖與水之間的強的氫鍵作用而使殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系仍保持溶液狀態。但當溫度升高時，β-甘油磷酸鈉的甘油部分與水之間的氫鍵作用增強、而殼聚糖鏈與水間的氫鍵作用減弱，同時殼聚糖與β-甘油磷酸鈉間的靜電作用增強，殼聚糖疏水作用也增強，導致殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液凝膠化［13］。

在β-甘油磷酸鈉質量濃度一定時，殼聚糖質量濃度越大，殼聚糖鏈間的氫鍵作用和殼聚糖整體的疏水作用就越強，殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液在相同的時間內凝膠化的溫度就會越低。當殼聚糖質量濃度一定，本身為弱堿性的β-甘油磷酸鈉質量濃度相對增大時，使殼聚糖主鏈上的電荷密度降低，游離出更多的胺基，導致殼聚糖鏈間靜電斥力減弱；同時殼聚糖與β-甘油磷酸鈉間的靜電引力也增大，而使得殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溶液凝膠化時間減少。

pH對凝膠化也有影響［14］。一定的pH范圍內，升高殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系的pH，溶液中質子減少，則游離氨基多，殼聚糖鏈間靜電斥力減小，分子鏈間氫鍵作用增強，使殼聚糖/β-甘油磷酸鈉在34℃時的凝膠化時間也減少。當pH≥7.2時，殼聚糖鏈上的電荷密度進一步減少，鏈間的靜電斥力進一步降低，使殼聚糖疏水作用和氫鍵引力相對提高，β-甘油磷酸鈉從殼聚糖鏈間被擠出而出現沉淀。故選擇殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系pH 7.1。

本實驗中體積配比為6∶1的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉體系常溫時可長時間持續保持液相，當溫度升高至34℃時，凝膠化時間為4 min，該凝膠溫度和鼻腔溫度33～35℃相近。殼聚糖和β-甘油磷酸鈉均具有良好的生物相容性，以氫溴酸東莨菪堿為模型藥物，制備得到的載藥凝膠測定其釋放度，結果表明，氫溴酸東莨菪堿鼻用原位凝膠釋放符合一級釋藥方程。在之后的實驗中，可對載藥凝膠的透皮吸收規律、添加劑的選擇、對鼻纖毛的毒副作用和藥效學等方面進行考察，為氫溴酸東莨菪堿的鼻腔制劑的進一步研究提供依據。

［1］ John H，Binder T，Hochstette H，et al.LC-ESIMS/MSquantification of atropine and six other antimu scarinic tropane alkaloids in plasma［J］.Anal Bioanal Chem，2010，396（2）：751-762.

［2］ Burton M J，Roland PS，Rosenfeld RM，etal.Extracts from the Cochrane Library：Scopolamine（hyoscine）for preventing and treatingmotion sickness［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2010，142（4）：468-471.

［3］ Fan Tengfei，Li Mingjun，Wu Xuemin，et al.Preparation of thermoresponsive and pH-sensitivity polymermagnetic；hydrogel nanospheres as anticancer drug carriers［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2011，88（2）：593-600.

［4］ Ruel-Gariepy E，Jean-Christophe L.In situ-forming hydrogels：review of temperature-sensitive systems［J］.Eur J Pharm Bio pharm，2004，58（2）：409-426.

［5］ Liu XM，Wang L S，Wang L，etal.The effectof saltand pH on the phase-Transition behaviors of temperature-sensitive copolymers based on N-isopropylacrylamide［J］.Biomaterials，2004，25（25）：5659-5666.

［6］ Chenite A，Chaput C，Wang D，etal.Novel injectable neutralsolutions of chitosan form biodegradable gels in situ［J］.Biomaterials，2000，21（21）：2155.

［7］ 王 津，陳莉敏，蔣智清，等.殼聚糖-明膠體系的溫敏凝膠及其藥物緩釋性能［J］.功能材料，2013，44（9）：1294-1295.

［8］ Washington N，Steele R JC，Jackson SJ，etal.Determination of baseline human nasal pH and the effectof intranasally administered buffers［J］.Int JPharm，2000，198（2）：139-146.

［9］ Cao S L，Zhang Q Z，Jiang X G.Preparation of ion-activated in preparation of ion-activated in situ gel systems of scopolamine hydrobromide and evaluation of its antimotion sickness efficacy［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28（4）：584-590.

［10］ Chenite A，Chaput C，Wang D，etal.Novel injectable neutralsolutions of chitosan form biodegradable gels in situ［J］.Biomaterials，2000，21（21）：2155-2161.

［11］ Winnik FM.Fluorescence studies of aqueous solutions of po1y（N-isopropylacrylamide）below and above their LCST［J］. Macromolecules，1990，23（2）：233-242.

［12］ Schuetz Y B，Gumy R，Jordan O.A novel thermoresponsive hydrogel based on chitosan［J］.Eur J Pharm Biopharm，2008，68（1）：19-25.

［13］ 曾 蓉，馮志遠，Smith R，等.變溫核磁共振對殼聚糖/磷酸甘油鹽溫敏性水凝膠的初步研究［J］.化學學報，2007，65（21）：2459-2465.

［14］ 郭亞可，李曉娟，熊 慶，等.含氨基化碳納米管的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溫敏凝膠的制備及性能研究［J］.中國藥學雜志，2014，49（1）：57.

Preparation of tem perature-sensitive nasal in situ gel of scopolam ine hydrobrom ide

LIMei-yan， LIN Yu*， OUYANG Xue， ZHENG Xin
（Chongqing Medical Uniυersity，Chongqing 400016，China）

AIM To prepare temperature-sensitive nasal in situ gel containing scopolamine hydrobromide. METHODS In situ gel containing differentmass concentration ratios of chitosan andβ-glycerophosphate were prepared under the condition of different pH values，and their gelation time，viscosity changes and the cumulative release weremeasured.RESULTS The in situ gel viscosity reached 5 Pa·s in the condition with pH valued 7.1，and volume ratio of 2%chitosan and 56%β-glycerophosphate reached 6∶1.Meanwhile，the gelation time after its initial gelation at34℃in the previouslymentioned condition tended to be shorterwith the temperature elevation，and increasement inmass concentration of chitosan，contentofβ-glycerophosphate and pH value rising from 6.5 to 7.2.When scopolamine hydrobromide asmodel drugwas loaded to temperature-sensitive gel，its cumulative release amounted to 71%in 10 h，and the release curve was in conformity to the first-order kinetic equation. CONCLUSION Temperature-sensitive in situ gel containing scopolamine hydrobromide，formed by chitosan andβ-glycerophosphate，shows sustained-release effectand therefore is suitable for the preparation of nasal formulation.

chitosan（CS）；β-glycerophosphate（β-GP）；temperature-sensitive gel；scopolamine hydrobromide；sustained-release

R944

A

1001-1528（2015）03-0517-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.012

2014-11-13

李美燕（1989—），女，碩士生，主要從事中藥制劑研究與開發、中藥制劑質量標準及中藥化學成分的研究。Tel：15025373975，E-mail：358674706@qq.com

林 於（1958—），女，教授，主要從事中藥制劑研究與開發、中藥制劑質量標準及中藥化學成分的研究。Tel：13452905223，E-mail：747746856@qq.com