三葉青相關序列擴增多態性-聚合酶鏈式反應體系的建立與優化

紀其雄， 彭 昕*， 吳曉菁， 楊雄志

（1.浙江醫藥高等專科學校，浙江　寧波　315100；2.太極集團浙江東方制藥有限公司，浙江　紹興　312000）

三葉青相關序列擴增多態性-聚合酶鏈式反應體系的建立與優化

紀其雄1， 彭 昕1*， 吳曉菁2， 楊雄志1

（1.浙江醫藥高等專科學校，浙江寧波315100；2.太極集團浙江東方制藥有限公司，浙江紹興312000）

目的 建立浙江和江西產的三葉青（Tetrastigma hemsleyanum）SRAP-PCR的反應體系和擴增程序。方法 應用L9（34）正交設計方法，以三葉青基因組DNA為模板，研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4種PCR反應組分濃度變化對擴增結果的影響，根據梯度PCR儀引物的條帶數量及清晰度選擇退火溫度。結果 優化后的25μL反應體系包含：10×PCR buffer2.5μL，2.5 mmol/LMgCl2，0.15 mmol/L dNTP，0.15μmol/L引物，1.0 U Taq DNA聚合酶，50 ng DNA模板。擴增程序的最佳退火溫度為51℃。并篩選出8對擴增產物豐富，多態性好的引物。結論 正交設計優化的三葉青SRAP反應體系，經過10份樣品檢驗，證明該體系穩定可靠，多態性好，可用于三葉青遺傳多樣性分析。

三葉青；相關序列擴增多態性-聚合酶鏈式反應（SRAP-PCR）；正交設計

三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國獨有的珍稀藥用植物，是抗腫瘤常用藥物［1-2］，也可用于治療風濕性關節炎、肝炎、高熱及病毒性腦膜炎等多種疾病。目前該植物野生資源瀕臨滅絕，其組培快繁技術雖有包括本課題組在內的一些探索［3-6］，但技術尚不夠成熟，滿足不了臨床需求。用分子標記的方法研究物種間親緣關系及種內遺傳多樣性，可為品種鑒別、良種選育、基因資源保護與利用等提供科學依據。而三葉青遺傳多樣性的評價及DNA指紋圖譜建立方面尚未見報道。

目前使用最廣泛的DNA分子標記技術有RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SNP和SRAP等。其中SRAP標記（sequence-related amplified polymorphism）是2001年由Li等［7］提出的基于聚合酶鏈式反應（PCR）的一種標記。基本原理是利用特殊的引物設計方式實現對ORFs（開放閱讀框架）的擴增，正向引物中的核心序列CCGG錨定ORF區的外顯子；反向引物中的核心序列AATT錨定內含子與啟動子。因不同個體的內含子、啟動子及其間隔區長度不等而產生多態性，從而擴增出豐富的SRAP多態性標記，具有多態性高，重復性好，操作簡單等特點，是一種比較理想的新型分子標記。本研究擬對影響三葉青SRAP-PCR反應體系的Mg2+，dNTP，模板DNA水平，TaqDNA聚合酶，引物濃度，退火溫度等因素進行優化實驗，旨在建立適用于三葉青的SRAP-PCR反應體系，為今后進一步開展三葉青種質資源遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建和品種鑒定等工作奠定實驗基礎。

1　材料與儀器

本實驗所有試劑及合成引物均購自上海生工生物工程有限公司，10個SRAP正向引物和10個SRAP反向引物序列見表1。Eppendorf Master cycler梯度PCR儀（德國Eppendorf公司），Gel Doc XR +紫外凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司），高速冷凍離心機（杭州納德公司），Sub-Cell系統水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

表1　三葉青SRAP標記分析的待選引物序列Tab.1 Primer sequence for SRAP analysis of T.hemsleyanum

本實驗所采用的三葉青材料，其中編號zj1～zj6的采自浙江麗水，編號jx1～jx4的采自江西弋陽，經麗水農科院吉慶勇高級農藝師和浙江醫藥高等專科學校楊雄志教授鑒定為Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg。

2　方法

2.1基因組DNA的提取與檢測 三葉青基因組DNA提取采用改良CTAB法［8］，經1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白檢測儀檢查總DNA濃度及其完整性，并用雙蒸水稀釋至50 ng/μL備用。

2.2SRAP-PCR擴增程序及反應體系 擴增程序為：95℃預變性5 min，（94℃40 s，40℃1 min，72℃1 min）5循環，（94℃40 s，50℃1 min，72℃1 min）35循環，72℃延伸10 min。PCR產物經含0.05%EB的2.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電極緩沖液為1×TAE，電泳電壓5 V/cm，紫外凝膠成像分析儀內觀察、拍照。原初擴增反應體系為：25μL PCR反應，10×緩沖液2.5μL，2.5 mmol/L MgCl2，1U Taq酶，25 ng模板DNA，0.2 μmol/L引物，0.1 mmol/L dNTP。

2.3退火溫度的篩選 先根據原初的PCR反應條件進行引物的初篩，選擇能看到清晰條帶的引物組合Me3和Em5對退火溫度進行考察。

2.4SRAP-PCR反應體系的正交試驗設計 采用L9（34）正交設計，對Mg2+、引物、dNTP和模板DNA進行四因素三水平篩選，見表2，每個處理3個重復，用Quantity one分析軟件對實驗結果按照特異性條帶強弱進行處理，特異條帶強、清晰度高、背景低的記為9分，與之相反最差的記分為1，其他的與其相比取整數值，對其從高到低依次打分［9-10］。

表2　SRAP-PCR反應L9（34）正交設計Tab.2 L9（34）orthogonal design for the factors and levels of SRAP-PCR reaction

2.5體系穩定性和多態性驗證 利用以上篩選出來的優化擴增條件對10份三葉青材料對反應體系的穩定性和多態性進行驗證，每個材料重復3次。

3　結果與分析

3.1退火溫度篩選實驗結果 退火溫度過低可能引起引物與模板錯配，非特異性產物擴增，溫度過高引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降。由梯度PCR儀自動生成的8個不同退火溫度對引物組合Me3和Em5擴增結果的影響見圖1，從圖中可以看出，雖然各溫度均能擴增出條帶，但條帶數量及清晰度有明顯區別，43～45.7℃時主要擴增出分子質量大的一些條帶，而且條帶較為彌散，53.8～56℃較高溫度時主要擴增出分子質量小的條帶，條帶清晰，但副帶逐漸減少，48.4～51℃時擴增出的條帶數量最多而且條帶清晰度較高，考慮較高退火溫度有利于減少雜帶的產生，因此，選擇51℃為三葉青SRAP擴增最佳退火溫度。

圖1　退火溫度對三葉青SRAP擴增的影響Fig.1 Effect of annealing temperature on T.hemsleyanum SRAP amp lification

3.2正交試驗結果 三葉青SRAP-PCR正交試驗結果見表2，表3和圖2。利用SPSS 17.0將上述記分結果進行方差分析和多重比較分析，結果表明，Mg2+濃度、dNTP、引物濃度及模板DNA濃度均對擴增結果有顯著的影響（P＜0.05）。均方差顯示各因素對結果影響的主次順序為：DNA模板濃度＞Mg2+濃度＞引物濃度＞dNTPs，進一步對各因素的不同水平進行多重比較，見表4，Mg2+濃度三個水平之間差異均達到顯著水平，P值分別為0.000（1.5與2 mmol/L之間）、0.000（1.5與2.5 mmol/L之間）和0.003（2與2.5 mmol/L之間），結合表2中PCR結果均值可知2.5 mmol/L為最適合Mg2+濃度。引物濃度在0.25μmol/L與其它兩個水平之間有顯著差異，P值分別為0.001（0.15和0.25μmol/L之間）和0.000（0.2與0.25μmol/L之間）0.15和0.2μmol/L之間為0.069，沒有顯著差異，結合表4中不同處理水平結果均值可知引物0.15或0.2μmol/L均為較佳濃度，考慮成本確定引物最佳濃度為0.15μmol/L。0.15和0.25 mmol/L dNTP濃度之間沒有顯著差異（P值為0.139），結合表4中不同處理水平結果均值可知0.15 mmol/L為最適dNTP濃度。模板DNA濃度三個水平間均有顯著差異，P值分別為0.000（25與50，25與75），0.032（50和75之間），結合表4中不同處理水平結果均值可知50 ng為最適模板用量。綜上所述，Mg2+濃度2.5 mmol/L，引物濃度0.15μmol/L，dNTPs0.15mmol/L，DNA模板50 ng為三葉青SRAP-PCR的最佳反應體系。

圖2　L9（34）正交設計SRAP擴增結果Fig.2 Electrophoresis of L9（34）orthogonal design

表3　正交試驗中各因素方差分析Tab.3 Analysis of variance for factors of orthogonal design

表4　各因素不同處理水平結果均值差異顯著性Tab.4 Significance among themeans of different factor levels

3.3引物篩選 在優化PCR反應體系的基礎上，以擴增出的條帶清晰度高，多態性好，重復性好為原則，從100對引物中篩選出8對引物組合（表5）。

3.4體系穩定性和多態性驗證 從圖3可見，引物組合Me3和Em5可以10份種質材料中擴增出清晰度高、多態性較高、重復性好的DNA條帶。這表明經過優化后建立的SRAP-PCR反應體系穩定可靠。

圖3　三葉青SRAP優化體系的穩定性檢測圖譜（M e3-Em5引物組合）Fig.3 SRAP-PCR p rofiles of 10 DNA sam p les from T.hemsleyanum w ith primer com bination M e3-Em5

表5　篩選出的三葉青SRAP標記分析的引物組合Tab.5 Prim er sequence screened for SRAP analysis of T.hemsleyanum

4　討論

SRAP是近年來出現的一種新型分子標記技術，它既克服了RAPD重復性差的缺點，又克服了RFLP、AFLP成本昂貴、技術復雜的缺點，目前廣泛用于物種DNA指紋圖譜構建［11］、品種鑒別［12］、親緣關系分析［13］、遺傳多樣性分析［14］及分子輔助遺傳育種等。但作為一種基于PCR的技術，結果受到反應體系和擴增程序的影響，為提高其穩定性和可靠性，對其反應條件進行優化是非常必要的。

擴增程序的設置中退火溫度的確定通常是至關重要的因素之一，退火溫度過高嚴重影響擴增產物數量及條帶數，而退火溫度過低則可能增加模板與引物之間非特異性的結合。本研究采用單因子梯度實驗的方法確定了所篩選出引物的最佳退火溫度。多項研究［15-16］表明，PCR反應體系中各因素之間往往存在著交互效應，因此，本研究采用正交設計法對PCR反應體系中各影響因素進行了篩選。大多數實驗［12，15］表明合適用量的Taq酶對PCR反應結果沒有顯著影響，且本研究對Taq酶用量做了初步梯度實驗，未發現其對PCR結果有明顯影響，因此，本次正交設計中未將其納入影響因素的研究對象。正交試驗的方差分析結果表明其余四個因素中DNA模板濃度對PCR擴增影響最大，DNA用量為25 ng時雖然主帶清晰，但副帶數量明顯最少，DNA用量在75 ng時，條帶數目雖然最多，但是背景模糊，條帶清晰度不高，在適中水平50 ng時背景干擾低、譜帶多態性高、主帶清晰、副帶明顯。可能是當DNA用量過少時一些低拷貝的基因片段擴增量不足，而DNA用量過高時，非特異性條帶的擴增增強，因此背景模糊，主帶清晰度降低，與王新民在杉木上［15］的研究結果一致，然而這與懷地黃［11］、山葡萄［12］實驗中得出的模板濃度對ISSR-PCR擴增結果的影響最不顯著的結論不同，這可能是由于本實驗中所采用的模板濃度恰在其擴增的閾值范圍，也可能是因為所采用的植物基因組不同，與引物配對的區域和嚴格程度不同。Mg2+是保證Taq酶活性必需的激活劑，濃度過低會導致產物產量降低，過高則會引起非特異性擴增，適宜的濃度一般為0.5～2.5 mmol/L。本實驗中，Mg2+濃度過低時，出現條帶缺失、亮度減弱等現象，而Mg2+濃度較高時，雖未出現明顯的非特異性條帶，但背景明顯模糊，擴增出的條帶清晰度明顯下降。引物濃度過低會影響產物形成，但過高容易形成引物二聚體或引起其他非特異性擴增，雖然本研究所選較適中的濃度范圍內條帶數量不足以產生明顯變化，但條帶的亮度和清晰度出現了一定程度的變化，引物濃度過低或過高都使條帶較彌散模糊，可能是因為降低了模板與引物特異性的配對。

dNTP是PCR反應中靶序列擴增的原料，濃度過低不足以完成設定的循環數就提前終止反應，影響擴增結果，而濃度過高則可能導致PCR錯配，從而出現非特異性擴增，同時濃度過高也會與Taq酶競爭Mg2+，造成酶活性降低，出現無擴增產物的現象［12］。本研究雖然dNTP的濃度對結果的影響也達到顯著的水平，但其是四個因素中最次要的因素，它對PCR結果的影響僅在于條帶亮度的區別，對條帶的數量及背景的清晰度沒有顯著影響，與西洋杜鵑［14］的SRAP研究上所得出的結論一致。

確定了最佳反應條件后采用了10份樣品對其進行驗證，得到了清晰穩定的擴增圖譜，雖然樣品數量有限，且10份樣品僅來源于浙江和江西兩個種源地，但該圖譜中所擴增出的10條帶中，多態性條帶仍有4條，多態性比率達到40%，因此，本實驗優化的SRAP-PCR反應適合后續用于三葉青遺傳多樣性分析及遺傳圖譜的構建。

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Establishment and optim ization of SRAP reaction system for Tetrastigma hemsleyanum

JIQi-xiong1， PENG Xin1*， WU Xiao-jing2， YANG Xiong-zhi1
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Taiji Group Zhejiang East Pharmaceutical Co.，Ltd，Shaoxing 312000，China）

AIM To establish the SRAP reaction system and PCR procedures for Tetrastigma hemsleyanum，collected from Zhejiang and Jiangxi Province，China.METHODS The orthogonal design was applied for optimizing seven factors in the SRAP-PCR reaction system，including Mg2+concentration，dNTP concentration，primer concentration，template DNA dosage，and Taq DNA polymerase dosage.The annealing temperature was chosen on the base of band number and resolution in gradient PCR apparatus.RESULTS The optimal reaction system for ISSR analysis comprised 2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTP，0.15μmol/L primers，50 ng of template DNA，and 1 U of Taq DNA polymerase in 25μL total volume.Proper annealing temperature was 51℃.Eight pairs of primerwhich had rich products and high polymorphism were selected.CONCLUSION SRAP-PCR reaction system for T.hemsleyanum is established and optimized in this study，which is supported using 10 germplasms，these results shows that the SRAP-PCR reaction system is stable and can be used for the genetic analysis of T.hemsleyanum.

Tetrastigma hemsleyanum；SRAP-PCR；orthogonal design

R282.5

A

1001-1528（2015）03-0562-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.022

2014-04-02

2013年浙江省公益性技術資助項目（2013C32103）；2013年浙江省教育廳高校科研項目（Y201330174）

紀其雄（1965—），男，碩士，講師，研究方向為藥學細胞工程。E-mail：ji_qixiong@126.com

彭 昕，副教授，研究方向為分子生物學。E-mail：pengx@mail.zjpc.net.cn