甘草對大鼠應激性潰瘍及多胺影響的研究

趙世清， 李茹柳， 年立全， 陶玉珠， 曾 丹， 陳蔚文

（1.廣州中醫藥大學，廣東　廣州　510006；2.廣州中醫藥大學脾胃研究所，廣東　廣州　510405）

甘草對大鼠應激性潰瘍及多胺影響的研究

趙世清1， 李茹柳2*， 年立全2， 陶玉珠2， 曾 丹2， 陳蔚文2

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州510006；2.廣州中醫藥大學脾胃研究所，廣東廣州510405）

目的 探討益氣健脾中藥甘草修復胃腸黏膜損傷的療效機制。方法 建立定量檢測胃腸黏膜中多胺的柱前衍生-高效液相色譜法；并在大鼠水浸-束縛應激性潰瘍模型上，觀察甘草水提物對胃腸黏膜損傷及多胺的影響。結果 建立了檢測胃和小腸黏膜中多胺（包括腐胺、精脒和精胺）的方法；甘草水提物能減輕應激性潰瘍大鼠胃黏膜損傷，減輕胃組織病理損害，提高胃黏膜多胺水平。結論 甘草水提物修復胃腸黏膜損傷的作用機制，可能與其影響多胺及其信號通路有關。

甘草；應激性潰瘍；多胺

胃腸黏膜損傷是臨床常見的病理改變，研究表明多胺在胃腸黏膜損傷修復中起重要作用，多胺的調控是眾多信號傳遞路徑的焦點［1-3］。胃腸黏膜保護是益氣健脾中藥的作用機理之一，本課題組在對小腸上皮細胞（IEC-6）的研究中發現，益氣健脾中藥黃芪、白術、黨參、甘草提取物對胃腸黏膜損傷修復的幾個環節如細胞增殖、遷移、分化有促進作用［4-7］，作用機制與其影響多胺調控信號通路有關［8-11］，并在IEC-6細胞建立了柱前衍生-高效液相色譜法檢測多胺（腐胺、精脒、精胺）的方法［12］，為了進一步在整體動物水平研究益氣健脾中藥胃腸黏膜損傷修復的作用機制，本實驗建立柱前衍生-高效液相色譜法檢測胃腸黏膜多胺的方法。選擇大鼠應激性潰瘍作為胃腸黏膜損傷模型，以益氣健脾中藥甘草作為治療藥物，考察胃腸黏膜多胺檢測方法的可行性、藥物對胃腸黏膜損傷修復過程多胺的影響，以探討益氣健脾中藥胃腸黏膜保護的療效機制。

1　實驗材料

1.1藥物及試劑 甘草藥材為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，由廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室童家赟講師鑒定。提取方法：甘草藥材加10倍量水浸泡30 min，熱回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮，冷凍干燥得甘草水提物（1 g提取物相當于3 g藥材）。臨用時用蒸餾水配成所需濃度。實驗劑量以藥材質量計算。

腐胺對照品（CAS.No.110-60-1，相對分子質量88.15，Sigma公司）；精脒對照品（CAS.No.124-20-9，相對分子質量145.25，Sigma公司）；精胺對照品（CAS. No.71-44-3，相對分子質量202.34，Sigma公司）；表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（批號AF-100-15，Peprotech公司）；考馬斯亮藍試劑盒（批號201110813，南京建成生物工程研究所）；色譜甲醇（德國MERCK公司）；高氯酸、苯甲酰氯、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯甲烷均為分析純。

1.2實驗動物 SD大鼠，SPF級，雌性，200～220 g，廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（粵）2008-0002。

1.3儀器 Agilent1200液相色譜系統（美國Agilent科技有限公司）；Hypersil ODS2液相色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；島津AUW120D分析天平（日本島津公司）；UVmini-1240型紫外可見分光光度計（蘇州島津公司）。

2　實驗方法

2.1柱前衍生-高效液相色譜法建立多胺檢測方法［12］

2.1.1多胺對照品溶液配制 分別精密稱取腐胺、精脒、精胺對照品0.015 05 g、0.019 20 g、0.016 56 g，各加色譜甲醇溶解定容至5 mL，分別得濃度為3.41×10-2mol/L、2.64×10-2mol/L、1.64×10-2mol/L的腐胺、精脒、精胺的單一對照品貯備液，吸取上述對照品貯備液（腐胺15μL、精脒60μL、精胺60μL）加入5 mL量瓶中，再加色譜甲醇稀釋至刻度，得腐胺、精脒、精胺分別為1.02× 10-4mol/L、3.17×10-4mol/L、1.96×10-4mol/L的對照品混合液。

2.1.2衍生化處理 取多胺對照品混合溶液1.0 mL，分別加入2 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL、苯甲酰氯8μL，渦旋混合后放置20 min，再依次加入飽和氯化鈉溶液2.0 mL、三氯甲烷2.0 mL，渦旋混合1 min，3 000 r/min離心10 min，吸取下層1.5 mL有機相，氮氣吹干。殘渣用0.5 mL的流動相（甲醇-水為55∶45）溶解在帶螺蓋的玻璃管中，50℃水浴放置8 h，所得溶液分別加2 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 mL和三氯甲烷2.0 mL，渦旋混合1 min，3 000 r/min離心10 min，吸取下層1.5 mL有機相，氮氣吹干，殘渣用0.5 mL流動相溶解。進樣前用0.22μm微孔濾膜過濾。

2.1.3色譜條件 Agilent 1200液相色譜系統，Hypersil ODS2液相色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；檢測波長234 nm；柱溫25℃；流動相為甲醇-水（55∶45），體積流量1.0 mL/min；進樣量為20μL。

2.1.4線性關系考察 上述處理好的對照品衍生物溶液，分別進樣1、2、5、10、15、20、25μL測定，以衍生化前對照品溶液中多胺的濃度折算進樣量（μmol）為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸。

2.2大鼠應激性潰瘍模型及黏膜多胺測定

2.2.1大鼠應激性潰瘍模型 正常組大鼠不造模，其他大鼠分為模型組、表皮生長因子（EGF）組、甘草水提物高劑量和低劑量組。大鼠禁食不禁水24 h，模型組以蒸餾水10 mL/kg灌胃，陽性對照藥組皮下注射EGF（100μg/kg）并以蒸餾水10 mL/kg灌胃，受試藥組以甘草水提物灌胃（分別為15 g/kg和7.5 g/kg）。大鼠給藥30 min后裝入特制的固定鼠籠，大鼠頭朝上放置于（19±1）℃水中，浸泡至大鼠胸部劍突水平，6 h后頸椎脫臼處死，立即取出胃腸組織。胃組織沿胃大彎剪開，另從幽門下5 cm起剪取15 cm小腸組織并剪開，冰凍生理鹽水沖洗胃腸內容物后，平鋪展平，拍照，觀察胃黏膜損傷程度，計算潰瘍指數。然后冰上刮取胃黏膜和小腸黏膜，-80℃保存，待檢測黏膜多胺含有量。

2.2.2潰瘍指數計算 肉眼觀察腺胃部黏膜損傷程度，計算黏膜潰瘍指數，參照Guth標準［13］：胃黏膜糜爛、潰瘍、出血等長度累計積分，正常為0分，斑點糜爛計1分，糜爛長度＜1 mm計2分，1～2 mm計3分，3～4mm計4分，＞4 mm計5分，各分值相加即為該大鼠潰瘍指數。

2.2.3病理組織學分析 取胃竇組織石蠟包埋，切片，HE染色后光鏡下觀察。

2.2.4黏膜中蛋白的測定 作為黏膜多胺定量檢測的計算步驟之一，需檢測黏膜蛋白量。從低溫冰箱取出待測的黏膜樣本，稱取胃或小腸黏膜各樣本適量，分別加2.0 mL生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10min，取上清液0.5mL加生理鹽水2.0 mL混勻，取0.05 mL加考馬斯亮藍試劑稀釋液3 mL，混勻，靜置5 min后于分光光度計595 nm處測定吸光度，以蒸餾水做空白對照，標準蛋白做隨行對照，并計算樣品中蛋白的含有量。

蛋白質量濃度（g/L）=［（測定管OD值-空白管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）］×標準管質量濃度（0.563 g/L）。

蛋白含有量（mg/g）=黏膜中測得的蛋白量/稱取的黏膜質量。

2.2.5黏膜多胺的衍生化處理 稱取胃或小腸黏膜各樣本適量，分別加5%冷高氯酸溶液1.5 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。取上清液1.0 mL進行衍生化，方法同“2.1”項下所述。

多胺含有量（10-10mol/mg）=（測得黏膜中的多胺量/黏膜質量）/對應黏膜的蛋白含有量。

3　實驗結果

3.1黏膜多胺檢測

3.1.1檢測方法 按照本課題組以往建立的多胺對照品檢測方法［12］，可同時檢測到3種多胺（腐胺、精脒和精胺）對照品的單一峰，說明在此實驗條件下可檢測腐胺、精脒和精胺。見圖1。

圖1　多胺對照品高效液相色譜圖

3.1.2多胺對照品標準曲線 以衍生化前對照品溶液中多胺的濃度折算進樣量（μmol）為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為：腐胺y=215.0x-1.058，r2=0.999 99，線性范圍0.069～1.729μmol。精脒y= 19.61x-5.661，r2=0.999 98，線性范圍7.138～178.451 μmol。精胺y=12.31x-3.933，r2=0.999 99，線性范圍4.419～110.487μmol。線性范圍內各樣品線性關系良好，為后續黏膜多胺測定提供了計算公式。

3.1.3正常大鼠小腸黏膜多胺測定 因大鼠小腸黏膜較易刮取得到，且小腸黏膜量比胃黏膜量充足，故黏膜多胺檢測方法建立用小腸黏膜進行。由圖2可見，本實驗建立的柱前衍生高效液相色譜法檢測黏膜多胺，可分別檢測到腐胺、精脒、精胺的單一峰，表明用此方法可同時檢測黏膜的3種多胺。

圖2　正常大鼠小腸黏膜多胺的高效液相色譜圖

3.2甘草水提物對大鼠應激性潰瘍及黏膜多胺的影響

3.2.1甘草水提物對大鼠潰瘍指數及病理組織學的影響表1可見，甘草水提物（15 g/kg）可降低應激性潰瘍大鼠胃黏膜潰瘍指數（與模型組比較P＜0.05），表明甘草水提物對胃黏膜損傷有治療作用，結果見圖3。

表1　甘草水提物對大鼠應激性潰瘍的影響

由圖3可知，正常組胃黏膜組織形態正常，結構完整；模型組可見胃黏膜表面上皮細胞受損、脫落，形成多個大小、深淺不等的糜爛面，黏膜間質明顯充血、水腫并伴有出血；EGF組和甘草高劑量組胃黏膜表面未見糜爛，間質充血、水腫程度明顯較模型組輕；甘草低劑量組的改變介于模型組和高劑量組之間，可見少數糜爛。

圖3　甘草水提物對應激性潰瘍大鼠胃組織病理的影響（HE染色，×200）

3.2.2甘草水提物對應激性潰瘍大鼠黏膜多胺的影響 表2可見，EGF和甘草水提物可提高應激性潰瘍大鼠胃黏膜精脒和精胺含有量，提示甘草水提物治療胃黏膜損傷的作用可能與其提高胃黏膜多胺含有量有關。因大鼠胃黏膜量本身較少，故刮取得到的胃黏膜量也少，難以達到腐胺的檢測限（腐胺與精脒、精胺相比含有量較少），故表2未列出腐胺檢測結果。

表2　甘草水提物對應激性潰瘍大鼠胃黏膜多胺的影響

表3可見，EGF和甘草水提物對應激性潰瘍大鼠小腸黏膜多胺無明顯影響。提示甘草水提物對應激性潰瘍大鼠黏膜多胺的影響主要在胃黏膜，對小腸黏膜多胺無明顯影響，可能與該模型病變主要在胃黏膜而不在小腸黏膜有關。

表3　甘草水提物對應激性潰瘍大鼠小腸黏膜內多胺的影響

4　討論

應激性潰瘍是臨床常見的胃腸黏膜損傷病變，胃腸黏膜損傷修復與多胺調控有重要關系［14］，鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是多胺合成的限速酶，研究表明應激性潰瘍大鼠胃和十二指腸黏膜糜爛后，黏膜細胞遷移也依賴多胺合成，應激后胃及十二指腸黏膜ODC活性明顯增加，而使用二氟甲基鳥氨酸（α-difluoromethylornithine，DFMO）后，抑制了ODC活性，則明顯抑制了胃腸黏膜的愈合［1］。還有研究表明，多胺釋放增加、給予表皮生長因子等能促進大鼠應激性潰瘍愈合［2］。說明多胺是胃腸黏膜損傷修復的重要影響因素。胃腸黏膜損傷修復是益氣健脾中藥的治療作用之一，因此對多胺含有量的影響可能是益氣健脾中藥胃腸黏膜保護的作用機制之一。

甘草性味甘平，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功能，臨床用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性等［15］。甘草是常用的益氣健脾中藥，也是益氣健脾著名方劑四君子湯、補中益氣湯、參苓白術散、小建中湯等的組成藥物。本實驗室在小腸上皮細胞（IEC-6）的實驗研究表明，甘草提取物有促進細胞增殖的作用［16］，甘草黃酮部位、甘草糖提取物有促進細胞遷移的作用［6，8］，甘草糖提取物、甘草黃酮提取物促進細胞遷移的作用與其影響多胺調控信號通路有關［8，17］。還有研究表明，甘草對消化道黏膜和細胞保護作用的分子藥理機制，與其影響細胞增殖與凋亡有關［18］。甘草酸可防護小腸上皮細胞DNA損傷，其機制可能與其上調P53、Gaad45α表達有關［19］。

本實驗室前期建立了柱前衍生-高效液相色譜法檢測小腸上皮IEC-6細胞多胺（腐胺、精脒和精胺）的方法［12］，本實驗在此基礎上建立了胃腸黏膜多胺的檢測方法，并在大鼠水浸束縛應激性潰瘍模型上，觀察甘草水提物對胃腸黏膜損傷及多胺的影響；結果表明，甘草水提物對應激性潰瘍胃黏膜損傷有治療作用，能降低胃黏膜潰瘍指數，減輕胃組織病理損害，并能提高胃黏膜多胺含有量，提示甘草保護胃腸黏膜的作用與其影響多胺含有量有關。本實驗在整體動物上的研究結果，與本課題組在細胞實驗的研究結論相互印證，表明益氣健脾中藥胃腸黏膜保護作用的藥效機制與其影響多胺及其信號通路有關。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0626-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.036

2014-05-19

國家自然科學基金項目（30772753，81173254）；中央財政支持地方高校發展專項資金項目（財教［2013］338）；廣州中醫藥大學中醫內科學特色重點學科建設項目（財教［2013］339）

趙世清（1986—），女，碩士，研究方向為中藥藥理和中藥化學。E-mail：553439879@qq.com

李茹柳 Tel：（020）36585444，E-mail：lrl@gzucm.edu.cn