七十味珍珠丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的改善作用

朱敏俠， 戎 浩， 劉曉麗， 王世華， 孫芳云， 李 楊

（西藏民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西　咸陽(yáng)　712082）

七十味珍珠丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的改善作用

朱敏俠， 戎 浩， 劉曉麗， 王世華， 孫芳云， 李 楊

（西藏民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712082）

目的 觀察七十味珍珠丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的改善作用及其分子機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、溶媒對(duì)照組和藥物組。七十味珍珠丸每日灌胃1次，預(yù)給藥7 d后采用大腦中動(dòng)脈阻塞模型，缺血40 min再灌注24 h，腦含水量測(cè)定評(píng)估腦水腫程度，Western blot法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦水腫明顯，AQP4蛋白表達(dá)明顯升高；而與模型組比較，藥物組大鼠腦水腫明顯改善，AQP4蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論 七十味珍珠丸可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫及AQP4蛋白表達(dá)。

七十味珍珠丸；腦缺血再灌注損傷；腦水腫；水通道蛋白4

腦卒中是危害中老年人身體健康和生命的主要疾病之一，在2008年衛(wèi)生部公布的第3次全國(guó)死因調(diào)查中顯示，腦卒中已超過惡性腫瘤成為中國(guó)第一致死病因，其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［1］。腦卒中包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中，缺血性腦卒中約占87%，其發(fā)病原因在于腦的主要供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞，疾病發(fā)展過程中或后期治療時(shí)局部閉塞的血管再通，從而發(fā)生腦缺血再灌注損傷［2］。

藏藥七十味珍珠丸（藏文譯音為然納桑培Rannasangpei，簡(jiǎn)稱RNSP），主要由佐太、天然珍珠、天然牛黃、羚羊角、麝香、藏紅花等七十余味名貴藏藥組成，具有安神、鎮(zhèn)靜、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和氣血、醒腦開竅的作用，在腦溢血、腦栓塞、高血壓、癲癇、腦卒中等疾病中廣為應(yīng)用［3-4］。七十味珍珠丸對(duì)腦缺血保護(hù)作用的研究結(jié)果顯示該藥對(duì)大腦動(dòng)脈血栓引起的局部缺血所致的行為障礙有改善作用，減少了腦梗死面積以及腦組織的病理學(xué)改變，說明該藥對(duì)腦缺血有保護(hù)作用［5］。本研究擬通過觀察七十味珍珠丸對(duì)腦水腫的改善作用及分子機(jī)制，進(jìn)一步探討該藥對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1　材料

1.1動(dòng)物 44只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠（200±20）g，SPF級(jí)，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥物和試劑 七十味珍珠丸（西藏自治區(qū)藏藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字Z54020062）。兔抗大鼠水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）抗體（1∶1 000；美國(guó)Santa Cruz公司）、小鼠抗大鼠β-actin抗體（1∶5 000；美國(guó)Millipore公司）、HRP標(biāo)記抗兔抗體（1∶1 000；美國(guó)Millipore公司）和HRP標(biāo)記抗小鼠抗體（1∶1 000；美國(guó)Millipore公司）。

1.3耗材與儀器 大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型栓線-AAAA級(jí)（北京沙東生物技術(shù)有限公司）；蛋白質(zhì)印跡法全套設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）；凝膠分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）。

2　方法

2.1動(dòng)物預(yù)處理給藥 大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（sham）、模型組（MCAO）、溶媒對(duì)照組（vehicle+ MCAO）和七十味珍珠丸藥物組，簡(jiǎn)稱藥物組（RNSP+ MCAO）。將七十味珍珠丸研磨成粉并用蒸餾水稀釋（終質(zhì)量濃度0.1 kg/L），藥物組以1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，溶媒對(duì)照組以蒸餾水灌胃，最后一次灌胃后1 h制作模型。

2.2局灶性腦缺血再灌注模型的制備 MCAO模型是模擬缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的首選模型［6］。6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位，頸部剪毛，常規(guī)消毒皮膚后，參照Longa線栓法［7］并加以改進(jìn)制備大鼠右側(cè)MCAO模型，先分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和翼顎動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，近心端穿線打一松結(jié)，血管夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和翼顎動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎線和近心端松結(jié)之間剪一小口將栓線插入頸總動(dòng)脈，拉緊松結(jié)的線并將遠(yuǎn)心端剪斷，頸外動(dòng)脈向頸總動(dòng)脈方向拉直，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線，插入長(zhǎng)度約18 mm（自頸總動(dòng)脈分叉處算起），再灌注時(shí)拔出栓線并結(jié)扎頸外動(dòng)脈斷端。假手術(shù)組插入栓線0.5～1 mm，其余操作同模型組。本課題選用缺血40 min再灌注24 h的時(shí)間點(diǎn)，再灌注結(jié)束后參照Longa評(píng)分法［7］進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，1～3分者入選后繼實(shí)驗(yàn)。

2.3腦含水量測(cè)定 大鼠麻醉斷頭取腦，將左右大腦半球分開，分別放在電子天平上稱濕質(zhì)量，記錄。然后置于100℃烘箱中烘烤72 h，稱干質(zhì)量，按照公式計(jì)算腦含水量：（腦濕質(zhì)量-腦干質(zhì)量）/腦濕質(zhì)量×100%。各組數(shù)據(jù)錄入計(jì)算機(jī)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot） 取大鼠右側(cè)海馬組織稱定質(zhì)量，加入裂解液勻漿提取上清，測(cè)量蛋白濃度，加入等體積2×loading buffer后煮沸5 min作變性處理，然后上樣跑電泳。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜置于封閉液中室溫孵育2 h后，加入一抗工作液，4℃孵育過夜，TBST洗膜5min×3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min，洗3次，ECL顯影液加于膜上反應(yīng)2 min，在凝膠成像系統(tǒng)中選擇合適的曝光時(shí)間進(jìn)行顯影，圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析并保存數(shù)據(jù)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均以SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1七十味珍珠丸降低腦含水量 腦缺血再灌注24 h，通過測(cè)量腦組織含水量來(lái)判斷腦水腫情況，缺血側(cè)大腦半球檢測(cè)結(jié)果表明：與假手術(shù)組（78.53±0.45）%比，模型組（81.95±0.63）%腦含水量明顯增加（P＜0.01）；而與模型組比，藥物組（79.16±0.38）%腦含水量減少（P＜0.05）。缺血對(duì)側(cè)大腦半球腦含水量在各組間沒有明顯變化，結(jié)果見表1。

表1　缺血對(duì)側(cè)和缺血側(cè)大腦半球腦含水量變化（±s，n=6）

表1　缺血對(duì)側(cè)和缺血側(cè)大腦半球腦含水量變化（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與溶媒對(duì)照組比較，△△P＜0.01

組別缺血對(duì)側(cè)大腦半球/%缺血側(cè)大腦半球/%假手術(shù)組78.09±0.28 78.53±0.45模型組78.06±0.27 81.95±0.63**溶媒對(duì)照組78.41±0.67 82.2±1.13**藥物組78.06±0.33 79.16±0.38#△△

3.2七十味珍珠丸減少海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá) 腦缺血再灌注24 h，Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與假手術(shù)組比，模型組（1.25±0.02，P＜0.01）AQP4蛋白表達(dá)明顯升高；與模型組比，藥物組（1.08±0.04，P＜0.01）AQP4蛋白表達(dá)下降，結(jié)果見圖1。

4　討論

水通道蛋白是一個(gè)水選擇性通道蛋白家族，目前已從哺乳類動(dòng)物鑒定出13種水通道蛋白亞型（AQP0-AQP12），它們分布在不同的組織中［8］。AQP4單體分子質(zhì)量為28 kDa，有1個(gè)由6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的水孔，在腦內(nèi)分布廣泛，包括小腦、海馬齒狀回、海馬CA1-CA3區(qū)、下丘腦視神經(jīng)上核和室旁核、新皮層、終紋核和韁核等［9］，而且主要表達(dá)在血-腦屏障、血-腦脊液屏障及滲透壓感受器的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上，這種分布特點(diǎn)提示它與腦內(nèi)的水平衡調(diào)節(jié)存在密切關(guān)系，是控制腦實(shí)質(zhì)內(nèi)外水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要信號(hào)分子［10-11］。

圖1　七十味珍珠丸減少M(fèi)CAO組大鼠海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá)（n=5，±s）

腦水腫分為細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，前者是由細(xì)胞代謝紊亂導(dǎo)致，后者是由血-腦屏障功能障礙及生物大分子降解導(dǎo)致［12］。AQP4在細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫的病理生理機(jī)制中非常重要，在細(xì)胞毒性腦水腫中，AQP4促進(jìn)水腫形成，在血管源性腦水腫中，AQP4促進(jìn)水腫消散［13-15］。大鼠局灶性腦缺血模型可造成細(xì)胞毒性腦水腫，造模后24 h，AQP4表達(dá)上調(diào)并直至造模后第7天，第3天上調(diào)最明顯，AQP4不僅在缺血中心區(qū)表達(dá)增多，在缺血周邊區(qū)域也表達(dá)增多，它的增多和腦水腫呈一致性［12，16］，而AQP4敲基因小鼠在腦缺血24 h后的腦水腫減輕、缺血面積和神經(jīng)缺失體征減少［13］，以上資料表明AQP4是局灶性腦缺血模型造模后參與腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要水通道蛋白。也有臨床報(bào)道，在腦梗死病人的大腦中，缺血中心區(qū)和邊緣區(qū)AQP4表達(dá)均上調(diào)［17］。

本課題研究結(jié)果顯示，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織水腫明顯，AQP4蛋白表達(dá)增高，與模型組比，七十味珍珠丸藥物組腦水腫明顯減輕，AQP4蛋白表達(dá)下降。本研究再次證實(shí)了AQP4參與了腦缺血再灌注損傷過程中腦水腫的形成，而七十味珍珠丸預(yù)給藥可明顯減輕腦水腫，減少AQP4蛋白表達(dá)，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，也為臨床上預(yù)防治療缺血性腦卒中提供了理論依據(jù)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0640-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.040

2014-05-10

西藏自治區(qū)科技廳資助項(xiàng)目（2010）；西藏民族學(xué)院校級(jí)資助科研項(xiàng)目（10myY07）

朱敏俠（1982—），女，博士，講師，主要從事腦缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的研究。Tel：（029）33755247，E-mail：zhuminxia2001@163.com