蒙藥玉簪花乙醇提取物體外和體內的抑菌活性研究

辛 穎， 白玉花

（內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古　通遼　028000）

蒙藥玉簪花乙醇提取物體外和體內的抑菌活性研究

辛 穎， 白玉花

（內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古通遼028000）

目的 研究蒙藥玉簪花乙醇提取物的體外、體內抑菌活性，為尋找新的抗菌藥物提供藥理學參考依據。方法

玉簪花；乙醇提取物；抑菌活性

玉簪花Hosta plantaginea是百合科玉簪屬宿根的草本植物，因其酷似古代婦女發髻上的玉簪而得名，有“江南第一花”的美譽［1］。玉簪花也叫白萼花、白鶴花，主要分布于亞洲的亞熱帶和溫帶地區，原產自我國和日本，我國各地均有栽培［2-3］。玉簪始載于《本草叢新》，書中記載：玉簪辛甘而寒，搗汁服，解一切毒。玉簪花的全草均能入藥，其花性涼味甘，具有微毒；葉、根入藥可治療化膿性中耳炎。玉簪花為蒙醫習用傳統藥材，蒙古名為邦占嘎爾布、查干邦占、哈斯-哈塔胡爾-其其格等，一般在夏、秋含苞待放時采收，及時陰干，主治咽喉腫痛、聲音嘶啞、肺熱等癥，具有清熱、解毒、止咳、利咽之功效［4-6］。《蒙藥正典》記載其性涼，味苦。用于治療咽喉腫痛、肺熱、毒熱；《認藥白晶鑒》中描述“玉簪生濕草地，花白者上品，味苦，治喉疾、解毒、清疫熱”［7］；《無誤蒙藥鑒》亦記有“玉簪花可以清肺熱、治喉疾和解毒等”［8］。百合科玉簪屬植物的主要化學成分為甾體皂苷［9-10］、黃酮［11］和生物堿類［12］。目前國內外的研究主要集中在玉簪花的化學成分及其解熱鎮痛抗炎的藥理活性方面，有關其抑菌作用的報道尚不多見。本研究擬觀察玉簪花的抑菌活性，為抑菌蒙藥玉簪花的開發提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1菌株、動物、主要試劑與儀器 乙型溶血性鏈球菌（beta hemolytic streptococcus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、變形桿菌（Proteusbacillusυulgaris）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、腸球菌（Enterococcus）和白色念球菌（Candida albicans）由內蒙古民族大學醫學院微生物實驗室提供。昆明種小鼠，雌雄兼用，體質量18～24 g，由吉林大學實驗動物飼養中心提供，許可證號：SCXK（吉）2008-0005。玉簪花購自通遼蒙藥廠。青霉素、鏈霉素購自上海生工。LB細菌培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，瓊脂2%，調pH為7.4～7.6，實驗用水為蒸餾水。雙目生物顯微鏡（北京上光儀器有限公司，XSP-2CA），電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司，DHP9012）；電子天平（北京儀特諾電子科技有限公司，DE-120 W）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海合恒儀器設備有限公司，DHG-9023A精密型）；恒溫振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司，HZQ/THZ）；旋轉蒸發儀（上海互佳儀器設備有限公司，RE-301）；智能電熱套（上海越眾儀器設備有限公司，ZNHW）；高壓滅菌鍋（威海新月化玻儀器設備有限公司，YXQ-LS-30SII）；雙人單面超凈工作臺（蘇州江東精密儀器有限公司，SW-CJ-2FB）。

1.2制備玉簪花乙醇提取物 取玉簪花藥材500 g，以95%乙醇提取2次，每次4 h，合并提取液并濃縮，得95%乙醇提取物，其提取得率為14.25%。過濾除菌后分別配制成含生藥0.01～10.00 g/mL的藥液備用。

1.3玉簪花乙醇提取物體外抑菌實驗

1.3.1溝槽法測定玉簪花乙醇提取物抑菌活性 菌懸液的制備：將8種菌從冰箱取出后，在LB瓊脂培養基上活化，再分別挑取單菌落于液體培養基中振蕩培養18 h，4 000 r/min離心10 min，用PBS洗一遍，再用PBS將菌懸液吸光度調至0.5左右，稀釋100倍（約含菌106cfu/mL）備用。實驗分為空白對照組（Ⅰ組，蒸餾水）、青霉素對照組（Ⅱ組，2 g/L）、鏈霉素對照組（Ⅲ組，2 g/L）及玉簪花乙醇提取物不同質量濃度組（0.01、0.10、1.00和10.00 g/mL，Ⅳ～Ⅶ組）。在固體平板培養基上，用無菌刀片沿直徑挖一細直的溝槽，在溝槽中分別加入Ⅰ-Ⅶ組備用藥物，然后在溝槽兩側用接種環分別劃線接種濃度為106cfu/mL的8種菌液，然后將固體平板置于37℃培養箱，24 h后觀察溝槽兩側細菌生長狀況。如果溝槽與細菌劃線接種交界處沒有出現細菌生長現象，則說明玉簪花乙醇提取物對該細菌有抑制作用，抑菌實驗結果判定為陽性（+）；若交界處出現細菌生長現象，則說明抑菌實驗結果為陰性（-）。

1.3.2藥物瓊脂培養基法測定玉簪花乙醇提取物抑菌活性

分別取瓊脂培養基27 mL裝入50 mL錐形瓶中，置50℃水浴備用，將玉簪花乙醇提取物的不同質量濃度組（0.01、0.10、1.00和10.00 g/m L，Ⅳ～Ⅶ組）加入到瓊脂培養基中，加入1.5 mL兔血，混勻后倒入平皿冷卻。用移液槍吸入5μL菌液到培養皿上涂成直徑為1 cm的圓后，置入37℃培養箱培養，24 h后觀察細菌生長情況。如沒有出現細菌生長現象，則說明玉簪花乙醇提取物對該細菌有抑制作用，抑菌實驗結果判定為陽性（+）；若出現細菌生長現象，則說明抑菌實驗結果為陰性（-）。

1.4玉簪花乙醇提取物體內抑菌實驗

1.4.1胃膜素混懸液的配置 稱取胃膜素20 g，放于研缽內，加少量生理鹽水研磨，加至400 mL，加壓滅菌10 min即可。臨用時調整其pH至7.0。

1.4.2菌液的制備 將菌液37℃培養16～18 h后，用無菌生理鹽水10倍比例稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度菌液，比濁法測定活菌數，再吸取稀釋好的不同濃度的菌液1 m L分別放于滅菌試管內，分別加入5%胃膜素混懸液9 mL，即做成濃度為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1× 103cfu/mL的細菌懸液備用。

1.4.3預實驗 將不同濃度的菌懸液分別注射于小鼠體內，每濃度組10只，腹腔注射乙型溶血性鏈球菌，0.5 mL/只，感染，腹腔注射金黃色葡萄球菌，0.5 mL/只，感染，觀察動物4 d內的死亡情況，選用引起小鼠80%～100%死亡的菌液濃度作為本研究中體內抑菌實驗的用量。

1.4.4玉簪花乙醇提取物體內抑制乙型鏈球菌和金黃色葡萄球菌的實驗 取昆明種小鼠108只，雌雄各半，按體質量隨機分為空白對照組、模型組、玉簪花乙醇提取物低、中、高劑量組（0.02、0.20、2.00 g/kg）。每組12只，玉簪花3個劑量組連續灌胃3 d后，第4天給藥30 min后除了空白組以外其他組根據菌株毒力預試實驗情況選取LD80-90（1×108）的細菌量感染小鼠，乙型溶血性鏈球菌腹腔注射感染，每只0.5 mL，金黃色葡萄球菌每只0.5 mL，腹腔注射。觀察小鼠一般狀況，觀察并統計4 d內各組小鼠的死亡率。當有小鼠死亡時，無菌操作分別取出小鼠腎臟，稱定質量研磨，用無菌生理鹽水配制成0.1 g/mL的組織懸液，取0.2 mL均勻涂布瓊脂平板，放置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察計數菌落。挑取培養出的菌落，用細菌測定儀對其進行鑒定。至感染第9天，非用藥組小鼠全部死亡，同時處死其余各組剩余小鼠，以同樣的方法做腎臟組織懸液培養。若無菌落生長而給藥劑量較大應考慮動物可能死于藥物毒性，存活動物心血標本培養應無菌。

1.5統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。各組間的死亡率比較采取卡方檢驗進行統計學分析。

2　結果

2.1玉簪花乙醇提取物體外抑菌實驗

2.1.1溝槽法實驗結果 空白對照組對8種致病菌均無抑制作用，青霉素對照組對白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性鏈球菌具有抑制作用。鏈霉素對照組對大腸桿菌、白色念珠菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌具有抑制作用。不同質量濃度的玉簪花乙醇提取物的抑菌效果不同，當玉簪花質量濃度為10.00 g/mL和1.00 g/mL時對乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。當玉簪花質量濃度降至0.10 g/mL和0.01 g/mL時對8種致病菌均無抑制作用。結果見表1。

表1　溝槽法檢測玉簪花乙醇提取物抑菌活性

2.1.2藥物瓊脂培養基法實驗結果 與空白對照組比較，青霉素對照組對白色念珠菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性鏈球菌具有抑制作用；鏈霉素對照組對大腸桿菌、白色念珠菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌具有抑制作用；玉簪花質量濃度為10.00 g/mL、1.00 g/mL和0.10 g/mL時對乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。結果見表2。

表2　藥物瓊脂培養基法檢測玉簪花乙醇提取物抑菌活性

2.2玉簪花乙醇提取物體內抑菌實驗 預實驗結果顯示對照組無動物死亡，1×108cfu/mL的致死率為83.33%，確定為本次實驗感染的菌液濃度。與空白對照組比較，模型對照組的動物死亡率為91.7%和41.7%（P＜0.01），表明造模成功。與模型對照組比較，玉簪花的中、高劑量組小鼠的死亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且平均存活天數增加。提示玉簪花乙醇提取物對乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌致小鼠感染死亡具有明顯的保護作用，顯示了玉簪花具有一定的體內抗菌作用。培養24 h后自然死亡小鼠都有菌落生長，第9天處死小鼠空白組無菌落生長，其他組較少有生長。鑒定結果為乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌。結果見表3。

表3　玉簪花乙醇提取物體內抑菌活性實驗

3　討論

玉簪花的全草均可入藥，根入藥可以起到清熱消腫、解毒止痛的作用，葉入藥具有消腫解毒的功效，而花入藥則能利濕、調經止帶。中藥記載用玉簪花的鱗莖可以清熱解毒、祛風除濕、鎮痛止血、消腫散瘀，臨床上用于治療風濕疼痛和關節腫大等癥。作為內蒙古地區蒙醫常用藥材的玉簪花，在《蒙藥正典》中記載其性涼、味苦，用于治療咽喉腫痛、肺熱和毒熱。蒙醫主要用玉簪花來治療急、慢性咽炎。

將玉簪花配制成醋治療耕牛的脫節爛頭病，其治療的有效率可達96.4%［13］。玉簪花根在治療骨質增生方面也有很好的治療效果［14］。有研究發現玉簪花的乙醇提取物具有明顯的鎮痛作用，可以在小鼠的熱板實驗中降低疼痛閾值；在醋酸扭體實驗中減少扭體次數［15］。玉簪花的化學成分中含有甾體類化合物，其具有一定的抗癌活性，對不同腫瘤細胞具有細胞毒選擇性［16］。玉簪全草中的生物堿對煙草花葉病毒、乙酰膽堿酯酶具有明顯抑制作用［17］。葉曉川等研究結果顯示，玉簪花的正丁醇萃取物對紅色毛癬菌和白色念球菌具有明顯的抑制作用；玉簪花的乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯，說明玉簪花具有一定的抑菌活性，推測其主要抑菌成分可能為黃酮類化合物和皂苷［18］。

目前有關玉簪花抑制細菌作用方面的研究很少，尤其是針對致病菌的報道更為少見。本研究選取了臨床常見的8種致病菌，觀察玉簪花乙醇提取物對8種致病菌的抑制作用，為將其開發為抗菌藥物提供實驗依據。本研究中溝槽法體外抑菌實驗結果顯示：玉簪花乙醇提取物對乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用。藥物瓊脂培養基法對玉簪花乙醇提取物抑制8種致病菌的實驗結果發現：玉簪花乙醇提取物在體外對乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，并且其抑菌作用隨濃度增加而增強，且玉簪花對青霉素、鏈霉素雙重耐藥的金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。本研究的體內抑菌實驗發現：玉簪花乙醇提取物灌胃給藥劑量高于0.20 g/kg時具有明顯的體內抑菌活性，且抑菌作用隨著濃度增加呈現增強的趨勢。有報道顯示玉簪花的主要化學成分為黃酮、甾體皂苷和生物堿類，究竟哪類成分是其抑菌成分，仍需要進一步探索。該研究可以為天然綠色資源植物玉簪花的開發、充分合理利用提供有價值的理論基礎和參考依據。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0653-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.044

2014-05-23

內蒙古自然科學基金資助項目（2011BS1204）

辛 穎（1980—），女，博士，副教授，從事蒙藥藥理學研究。Tel：（0475）8314894，E-mail：xinying20081115@163.com

體外實驗分為空白對照組（Ⅰ組）、青霉素對照組（Ⅱ組）、鏈霉素對照組（Ⅲ組）和玉簪花乙醇提取物的不同質量濃度組（0.01、0.10、1.00、10.00 g/mL）組（Ⅳ～Ⅶ組）。醇提法制備玉簪花的乙醇提取物，溝槽法和含藥瓊脂培養基法檢測玉簪花乙醇提取物對乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、白色念球菌的體外抑菌活性。體內實驗分為空白對照組、模型組和玉簪花低、中、高劑量組（0.02、0.20、2.00 g/kg），以乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌種，小鼠灌胃給予玉簪花乙醇提取物7 d后，腹腔注射乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌，通過觀察小鼠死亡率衡量玉簪花乙醇提取物的體內抗菌活性。結果 體外抑菌試驗顯示，當玉簪花質量濃度高于1.00 g/mL，玉簪花乙醇提取物對乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用。在體內抑菌實驗中，玉簪花乙醇提取物中、高劑量具有抑制乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌的作用，與空白對照組的小鼠死亡率相比，小鼠死亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結論 蒙藥玉簪花乙醇提取物中含有抑菌的活性成分。