Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝研究

黃 飛， 張 哲， 魏先文， 陳國(guó)平， 楊富功， 楊可可

（1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽　黃山　245041；2.安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽　馬鞍山　243002）

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝研究

黃 飛1， 張 哲1， 魏先文2， 陳國(guó)平1， 楊富功1， 楊可可1

（1.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山245041；2.安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽馬鞍山243002）

目的 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取煙葉中煙堿工藝。方法 以煙堿的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察浸泡時(shí)間、固液比、微波功率、微波輻射時(shí)間4個(gè)因素對(duì)煙堿提取率的影響，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取工藝，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果 浸泡時(shí)間、微波輻射時(shí)間、固液比、微波功率對(duì)煙堿的提取率具極顯著影響，確定微波輔助提取煙堿的最優(yōu)提取工藝為：浸泡時(shí)間為6 h，微波輻射時(shí)間7 min，固液比為0.1，微波功率為800W。結(jié)論 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取煙葉中煙堿工藝，建立的數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)相符，該提取工藝合理，精確度高，可預(yù)測(cè)性好。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；微波輔助；廢次煙葉；煙堿；提取

煙堿又稱(chēng)尼古丁（nicotine，Nic），是煙草的主要成分之一。一般人們認(rèn)為煙堿是煙葉中的主要毒性物質(zhì)，其實(shí)這是一種誤解。流行病學(xué)研究報(bào)告表明，煙堿可以有效清除活性氧自由基，能夠抑制多巴胺自氧化，可以降低老年癡呆癥和帕金森氏綜合癥的發(fā)病率［1-2］，能治療精神分裂癥、抑郁癥等，對(duì)婦女子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等雌激素依賴性疾病有較好的療效［3］。煙堿還可以用于戒煙，提高戒煙的成功率，避免吸煙產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)身體的毒害［4-5］。

目前從煙葉中提取煙堿的常見(jiàn)方法有水蒸氣蒸餾法［6］、連續(xù)逆流提取法［7］、溶劑萃取法［8］、超臨界萃取法［9］、離子交換法［10］、超聲輔助酶法［11］等。以上方法設(shè)備成本、技術(shù)要求較高，萃取過(guò)程中可能有新的組分產(chǎn)生等缺點(diǎn)。微波輔助提取可以顯著加速傳質(zhì)過(guò)程，提高提取效率，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用［12］。與傳統(tǒng)的提取方式相比較，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。微波輔助提取大多是采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)煙堿提取工藝進(jìn)行考察［11，13-14］，考慮正交設(shè)計(jì)的局限性，本研究以廢次煙草為原料，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廢次煙葉中煙堿的工藝，獲得了優(yōu)化的微波提取工藝條件，該方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

1　儀器與試劑

1.1儀器 UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司）；NMS72SF型微波爐（上海微波爐有限公司）；FZ102型微量植物粉碎機(jī)（上海申光儀器儀表有限公司）；BT25S電子天平（賽多利斯）。

1.2試劑 廢次煙葉（Nicotiana tabacum L.，購(gòu)自黃山市煙草收購(gòu)站，批號(hào)20130824，經(jīng)黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室柯仲成鑒定為茄科煙草）；99%煙堿對(duì)照品（購(gòu)于西安云芝生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)20130312），甲基橙、三氯甲烷、乙醇、檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液均為分析純（中國(guó)國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取煙堿標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分別注入60 mL分液漏斗中，加入檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖溶液2 mL、甲基橙溶液2 mL，混合均勻后加入三氯甲烷5 mL，萃取2 min，靜置分層，取三氯甲烷層加入1 cm比色皿中，測(cè)其波長(zhǎng)420 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，煙堿濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作出回歸方程y=-0.022 42+5.462 35x，相關(guān)系數(shù)為r=0.997 7［15］。

2.2提取液中煙堿的測(cè)定 取10.00 g廢次煙葉，用微型植物粉碎機(jī)粉碎，以一定的固液比加入乙醇，浸泡一定時(shí)間后，以一定功率的微波處理一定時(shí)間，冷卻后于3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液1 mL，加入2 mL檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液和2 mL飽和的甲基橙溶液，搖勻后加入5 mL三氯甲烷，震蕩2.5 min，靜置分層。取三氯甲烷層加入1 cm比色皿中，測(cè)其420 nm處吸光度［13，16］。根據(jù)測(cè)得的吸光度，用回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度，計(jì)算煙堿提取率。

2.3Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化微波提取工藝條件

2.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，煙堿微波輔助提取較為顯著的影響因素有浸泡時(shí)間、微波輻射時(shí)間、固液比、微波功率和提取次數(shù)等。考慮到提取次數(shù)為非連續(xù)變量因素，回歸方程處理較為復(fù)雜，故根據(jù)實(shí)際情況，將其固定為1次。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的研究思路和Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)各因素進(jìn)行3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用代碼值-1、0、1來(lái)表示。代碼值所代表的實(shí)際值見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

多元線性回歸：Y=87.67+2.50X1+4.24X2+1.99X3+ 5.56X4（r2=0.831 7）

由表3回歸方程的方差分析結(jié)果可知，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi)，浸泡時(shí)間、微波輻射時(shí)間、固液比、微波功率對(duì)煙堿的提取率有極顯著的影響，浸泡時(shí)間和固液比、固液比和微波功率的相互作用具有非常顯著影響，浸泡時(shí)間和微波輻射時(shí)間的相互作用具有顯著影響。浸泡時(shí)間和微波功率、微波輻射時(shí)間和固液比、微波輻射時(shí)間和微波功率的相互作用沒(méi)有顯著影響。回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明其他未知因素對(duì)該試驗(yàn)干擾比較小。擬合檢驗(yàn)極顯著，說(shuō)明該二項(xiàng)式方程與實(shí)際提取情況擬合很好，較好地反映了煙堿提取率和浸泡時(shí)間、微波輻射時(shí)間、固液比、微波功率的關(guān)系。因此，該二項(xiàng)式方程較好地描述了煙堿提取率隨各個(gè)因素的變化規(guī)律，具有良好的預(yù)測(cè)指導(dǎo)性［17-21］。

表3　回歸方程的方差分析

2.3.3效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè) 根據(jù)二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件，繪制考察指標(biāo)與影響較顯著的兩個(gè)自變量的三維效應(yīng)曲面圖及等高線圖，如圖1所示。利用回歸模型進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)煙堿的提取率最大值為98.43%，最優(yōu)提取工藝條件為：浸泡時(shí)間為6 h，微波輻射時(shí)間7 min，固液比為0.1，微波功率為800W。

2.3.4驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)測(cè)得出的最優(yōu)提取工藝條件，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，煙堿的提取率分別為97.23%、96.58%、97.35%，平均值為97.05%，RSD為1.5%，偏差率=（97.05%-98.43%）/98.43%=-1.40%，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件具有較好重復(fù)性。

3　討論

在多數(shù)的情況下，各因素對(duì)效應(yīng)的影響并非是線性的，國(guó)內(nèi)一般采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝、篩選處方，即用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，雖然試驗(yàn)次數(shù)較少，但是精確度較低，預(yù)測(cè)性較差。選擇適合于非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以提高優(yōu)化效果，Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法就是一種較為成熟的方法。本實(shí)驗(yàn)采用這種方法，可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，充分考慮了各因素之間的交互作用，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)性，已被較多地應(yīng)用于化學(xué)合成過(guò)程、生物過(guò)程等優(yōu)化，具有較好的應(yīng)用價(jià)值前景。

圖1　各因素對(duì)響應(yīng)值影響的三維效應(yīng)曲面圖和二維等高線圖

效應(yīng)面優(yōu)化法在藥物制劑中應(yīng)用較為廣泛［22-25］，但還沒(méi)有很好地應(yīng)用于現(xiàn)代中草藥行業(yè)中。本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)微波輔助提取煙堿的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)合理的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0670-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.049

2014-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21271006）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（AH201310375027）；安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2013SQRL088ZD）；黃山學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2012xkj006）

黃 飛（1983—），男，碩士，助教，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。Tel：（0559）2546625， E-mail：huangfei@hsu. edu.cn