Box-Behnken設計優選藏藥坐珠達西供試品溶液制備條件

任桂友，徐 燕，李春雪，曾 銳*

（1.西南民族大學化學與環境保護工程學院，四川　成都　610041；2.成都中醫藥大學藥學院，四川　成都　611137）

Box-Behnken設計優選藏藥坐珠達西供試品溶液制備條件

任桂友1，徐 燕1，李春雪2，曾 銳1*

（1.西南民族大學化學與環境保護工程學院，四川成都610041；2.成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137）

目的 采用Box-Behnken設計響應面法優化藏藥坐珠達西的供試品溶液的制備條件，確定最佳的提取制備方法。方法 選取加甲醇量、超聲時間、超聲溫度為考察因素，以沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ8種成分量的總評歸一值（OD）為指標，采用Box-Behnken設計優化坐珠達西樣品的提取制備條件。結果 最佳提取制備工藝為加甲醇15 mL，超聲30 min，超聲溫度為80℃，重復3次試驗，各成分量的RSD在1.1%～2.7%范圍內。結論 優選的提取制備條件穩定可行，可為坐珠達西質量標準研究的樣品提取制備提供參考。

Box-Behnken設計；坐珠達西；供試品溶液；制備條件

Box-Behnken設計響應面法［1-3］是一種可以把實驗設計和統計分析高效結合的綜合實驗方法。然該設計方法現多用于普通劑型處方的篩選，對于質量標準研究的供試品制備條件考察尚未引起足夠重視。

藏藥坐珠達西由35味藥物組成，成分眾多，且相互間存在一定干擾。因此科學準確的供試品制備方法，對最終的質量標準研究尤為重要。現今藏藥坐珠達西的研究主要是集中在和其他藥物配合的臨床應用、重金屬及毒性評價研究等方面［4-9］。本課題組前期建立了坐珠達西中沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ8種成分定量測定方法［10］，后又以槲皮素、胡椒堿、齊墩果酸為代表探索黃酮、有機酸、生物堿同時鑒定的檢測方法?，F報道以沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ8種成分量的總評歸一值（OD值）為考察指標，優選坐珠達西供試品溶液制備條件，以確定其最佳提取制備方案。

1　材料

Waters 2695型高效液相色譜儀；2996PDA檢測器；Empower化學工作站（美國）；ESJ200-4萬分之一電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；BT25S十萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

沒食子酸（批號111109）、苯甲酸（批號120807）、山柰酚（批號120718）、木香烴內酯（批號120322）、去氫木香烴內酯（批號120321）、西紅花苷Ⅰ（批號120714）、西紅花苷Ⅱ（批號110925）對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；綠原酸（批號121125）對照品（成都普菲德生物技術有限公司）。8種對照品純度均≥98.0%；坐珠達西（丸劑）供試品（批號20130926，四川阿壩州藏醫院藏醫藥研究所制）。流動相甲醇為色譜純（OCEANPAK）；磷酸為分析純（純度≥85.0%）；提取用甲醇為分析純（純度≥99.5%），二者均購自成都市科龍化工試劑廠；水為純凈水。

2　方法與結果

2.1方法學考察

2.1.1色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，13%～20%A；8～20 min，20%～38%；20～30 min，38%A～50%A；30～45 min，50%A～70%A；45～65 min，70%A～80%A）；體積流量為1 mL/min；柱溫30℃；進樣量10μL；沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯和去氫木香烴內酯的檢測波長為225 nm，綠原酸的檢測波長為352 nm，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的檢測波長為455 nm。按照上述色譜條件進行測定，各組分間分離度良好，對照品及樣品色譜圖見圖1。

2.1.2對照品溶液的制備 稱取沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯和綠原酸適量，精密稱定，加甲醇配制或稀釋成每1 mL含1.224 0、1.068 3、0.747 5、0.776 3、1.002 9、1.011 4 mg的溶液；再取西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ適量，精密稱定，加稀乙醇配制或稀釋成每1 mL含1.420 0、0.375 0 mg的溶液，即得各對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各2.5、1.5、1.0、2.0、3.5、3.5、0.5、0.5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。

圖1　對照品和樣品HPLC圖譜

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱取坐珠達西粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密量取加入甲醇15 mL，密封稱定質量，超聲提取，待冷卻至室溫，再用甲醇補足失質量，搖勻，過濾即得。

2.1.4線性關系的考察 將“2.1.2”項下混合對照品溶液依次稀釋為原液質量濃度的1/2、1/22、1/23、1/24、1/25，分別精密吸取不同稀釋倍數及原質量濃度的對照品溶液各10μL進樣，以進樣質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程及相關系數，見表1。

表1　對照品的線性關系和范圍

2.1.5精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下稀釋1倍的混合對照品溶液，按“2.1.1”項下所述色譜條件，連續進樣6次，每次10μL，計算各組分峰面積的RSD。結果顯示，沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為1.0%、0.6%、1.6%、0.7%、1.1%、1.5%、0.76%、1.6%，表明該儀器精密度效果良好。

2.1.6重復性試驗 精密稱取同一份坐珠達西樣品粉末6份，按“2.1.3”項下所示方法平行制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示，沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為1.7%、2.3%、1.0%、1.7%、2.5%、1.1%、1.3%、2.1%，表明該試驗方法重復性良好。

2.1.7穩定性試驗 精密稱取同一份坐珠達西樣品粉末，按“2.1.3”項下所示方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h時進樣10μL，按“2.1.1”項下所述色譜條件進行測定，計算各組分峰面積的RSD。結果顯示，供試品溶液中沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為2.8%、3.6%、2.4%、1.6%、1.5%、1.0%、3.2%、2.8%，表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的坐珠達西樣品粉末6份，每份約1 g，置具塞錐形瓶中，加入各對照品溶液（使得加入對照品量相當于樣品中含有量的80%～120%）適量，按“2.1.3”項下所示方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下所述色譜條件進行測定，計算各對照品的回收率和RSD，結果見表2。

2.2供試品制備提取工藝優選

2.2.1Box-Bhenken設計 以加甲醇量、超聲時間、超聲溫度為影響因素，以沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷I和西紅花苷II的含有量的總評歸一值（OD）［11-13］為評價指標進行Box-Bhenken試驗設計。各因素水平見表3。

2.2.2樣品溶液制備 精密稱取同一批坐珠達西樣品粉末（批號20130926）17份，各1 g，按表4中的方案設計進行樣品溶液制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含有量。

2.2.3模型擬合及數據分析 實驗所得結果（見表4～表5，圖2）經Design Expert8.0.5b軟件進行多元線性回歸擬合及優化，得到OD值對加甲醇量A、超聲時間B、超聲溫度C的二元回歸方程：

剔除不顯著項（P≥0.05），重新擬合得到二項式方程

表2　8種有效成分的加樣回收率（n=6）

表3　提取因素水平

表4　響應面分析方案及結果

表5　回歸模型方差分析

2.2.4供試品制備工藝預測 由Design Expert8.0.5b軟件分析得出的響應曲面圖（圖2）可知，加甲醇量對OD值影響最大。經Design Expert8.0.5b軟件分析篩選、優化，得到供試品制備最佳工藝條件為：加甲醇量15mL，超聲時間30 min，超聲溫度80℃。試驗是將坐珠達西研成粉末再進行提取，考慮粉末體積大，甲醇量再少便不能使藥粉與提取溶劑充分接觸，故確定用15 mL的甲醇進行提取，同時為了實際操作需求，80℃的提取溫度也不再做升高。

圖2　響應面圖

2.2.5驗證試驗 精密稱取同一份坐珠達西樣品粉末3份，按已優化的方法平行制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析。結果顯示，沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含有量的RSD分別為2.7%、1.1%、0.9%、1.5%、2.3%、2.1%、1.5%、2.3%，表明所建數學模型具有良好的預測性，優選工藝條件穩定可靠。

3　討論

3.1本課題組前期建立了沒食子酸、苯甲酸、山柰酚、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、綠原酸、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ8個成分的定量測定方法。本研究再次進行驗證，并最終確定最佳制備提取方案為加甲醇量15 mL，超聲時間30 min，超聲溫度80℃。建議在進行坐珠達西質量標準研究時，供試品制備條件應選用加甲醇量15 mL，超聲時間30 min，超聲溫度參考試驗的實際情況和條件而定。

3.2本實驗中觀察得知，不同試驗條件下各成分測定結果差異很大，以木香烴內酯最明顯，其最佳條件與最差條件下含有量差異達到了1.774 3 mg/g，故建議在試驗過程中，供試品制備環節也要引起學者們足夠的重視，以便確保最終試驗結果的客觀、科學、可靠。

［1］ 吳 偉，崔光華.星點設計-效應面優化法及其在藥學中應用［J］.國外醫藥學分冊，2000，27（5）：292-298.

［2］ 曾 銳，任桂友，王 爽，等.Box-Behnken設計及正交設計優選復方龍砂顆粒提取工藝［J］.中成藥，2014，36（5）：202-205.

［3］ 林小玲，田成旺，張鐵軍.星點設計-效應面法優選參芪消炎顆粒滲漉提取工藝［J］.中草藥，2013，44（4）：430-434.

［4］ 杜麗英.坐珠達西配合附子理中丸治療原發性肝癌腹瀉52例臨床觀察［J］.中醫臨床研究，2011，3（13）：35-36.

［5］ 王海蘋.淺談藏藥坐珠達西的臨床應用［J］.中國民族民間醫藥，2014，1（4）：4-5

［6］ 胡文玉.坐珠達西配合黃芪注射液以及小半夏丸治療消化道腫瘤后嘔吐的臨床觀察［J］.吉林醫學，2011，32（8）：1500-1501.

［7］ 旦 增，許 曄，胡 忻，等.名貴藏藥“坐珠達西”重金屬含量分析及毒性評價［J］.西藏大學學報：自然科學版，2013，28（1）：32-36.

［8］ 徐蓮琴，楊慶敏，王 燁，等.坐珠達西治療消化性潰瘍臨床觀察［J］.黑龍江醫藥，2009，22（3）：346-347.

［9］ 劉瑞珍.坐珠達西配合四神丸及黃芪注射液治療肝癌腹瀉32例臨床療效觀察［J］.亞太傳統醫藥，2011，7（9）：123-124.

［10］ 任桂友，劉海萍，王戰國，等.藏藥坐珠達西中8種成分HPLC定量測定［J］.中草藥，2014，45（15）：2189-2193.

［11］ 符少蓮，馮翠娟，李 沙.星點設計-效應面法優化脂溶性丹參提取物速釋滴丸處方工藝［J］.中成藥，2014，36（5）：690-695.

［12］ 陳衛衛，何煒玲，馮 看，等.星點設計-效應面法優選抗炎退熱顆粒劑的成型工藝［J］.中成藥，2011，33（9）：1610-1612.

［13］ 唐 梅，劉劍云，劉 英，等.Box-Behnken設計優化黃芩的浸漬-壓榨提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）：58-61.

R284.2

B

1001-1528（2015）03-0674-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.050

2014-06-20

國家“十二五”科技支撐計劃（2012BAI27B07）；大學生創新項目資助（S201410656002）；校研究生學位點建設項目（2013XWD-S0703）

任桂友（1990—），碩士生，從事藥物制劑及民族藥的研究。Tel：13540108836，E-mail：rgy506189795@126.com

曾 銳（1976—），副教授，碩士生導師，從事藥物制劑及民族藥的研究。Tel：13981910281，E-mail：Mackzeng@ gmail.com