速效救心丸干預心肌缺血/再灌注大鼠線粒體通透性轉換孔及心肌細胞凋亡

陳亞妮， 高俊杰， 朱文葉， 陳鐵軍， 沈智杰， 王肖龍

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管科，上海　201203）

［藥 理］

速效救心丸干預心肌缺血/再灌注大鼠線粒體通透性轉換孔及心肌細胞凋亡

陳亞妮， 高俊杰， 朱文葉， 陳鐵軍， 沈智杰， 王肖龍*

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管科，上海201203）

目的 觀察速效救心丸（川芎、冰片）對心肌缺血/再灌注大鼠線粒體通透性轉換孔及心肌細胞凋亡的影響。方法 將55只SPF級Wistar大鼠隨機分為空白組，模型組，速效救心丸低、中、高劑量組（每組11只）。藥物組給予對應劑量的速效救心丸混懸液灌胃，空白組與模型組給予同等容積的雙蒸水灌胃，連續灌胃7 d結束后結扎左冠狀動脈前降支建立心肌缺血/再灌注大鼠模型。觀察速效救心丸干預后心肌線粒體通透性轉換孔（MPTP）、細胞色素C的表達情況，并采用TUNEL檢測心肌細胞凋亡，HE染色觀察大鼠心肌細胞形態。結果 與空白組比較，模型組MPTP開放程度增加，細胞色素C水平升高（P＜0.05），TUNEL的陽性反應面積率顯著上升（P＜0.01）。速效救心丸高、中、低劑量組的TUNEL陽性反應面積率等較模型組降低（P＜0.01），但藥物組間比較無統計學差異。速效救心丸高劑量組的MPTP開放程度（P＜0.05）、細胞色素C水平（P＜0.01）較模型組降低。結論 速效救心丸對大鼠心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護作用，其機制可能與抑制MPTP的開放有關。

速效救心丸；線粒體通透性轉換孔；細胞凋亡；細胞色素C

近年來，急性心肌梗死在我國的發病率有明顯增高的趨勢。心梗面積的大小對于心梗病人的死亡率起著決定性的作用。目前最有效的辦法是在心梗發作后越短的時間內進行溶栓或者介入手術。雖然，再灌注的益處不可否認，但是其副作用也不可忽視，包括心肌頓挫、室性心律失常和不可逆的心肌再灌注損傷等，其損傷甚至可能抵消一部分心肌再灌注的好處。越來越多的證據表明，不可逆的心肌再灌注損傷的機制可能與線粒體通透性轉換孔（MPTP）的開放有關，該非特異性通道的開放，使線粒體膜電位崩潰，呼吸鏈斷裂，ATP合成分解失衡，細胞色素C和其他促凋亡因子釋放［1-4］。Argaud等［5］發現在離體大鼠心臟中，缺血期，MPTP關閉，但是再灌注時，MPTP開放。由于線粒體通透性轉換孔的開放在心肌再灌注損傷所導致的心肌壞死中是一個非常重要的過程，因此也為心肌細胞的保護提供了可能的靶點。

速效救心丸的臨床療效確切，本課題組發現速效救心丸可降低急性冠脈綜合征患者冠狀動脈介入（PCI）術后的CK、CK-MB、TnI水平［6］。本實驗通過對缺血/再灌注大鼠的速效救心丸預處理，從線粒體的角度探討速效救心丸對缺血/再灌注損傷的保護機制。

1　實驗材料

1.1實驗動物 SPF級別健康成年Wistar雄性大鼠55只，體質量180～200 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號2007000562281。所有大鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。

1.2實驗藥物 速效救心丸，由天津中新藥業集團股份有限公司第六中藥廠生產（批號618034）。將速效救心丸碾磨成細粉，溶解于雙蒸水，制備成質量濃度為32 g/L、64 g/L和128 g/L的混懸液。

1.3主要試劑 大鼠細胞色素C ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；純化線粒體膜通道（MPTP）比色法檢測試劑盒（上海一基實業有限公司）；DeadEndTMColorimetric TUNEL System（由Promega提供，LOT：0000086338）。

1.4主要儀器 Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶標儀（芬蘭制造）；微量恒溫器（紹興市衛星醫療設備制造有限公司）；轉移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；光學顯微鏡、熒光過濾器（Olympus）；實驗動物心電圖儀（日本光電公司生產）。

2　實驗方法

2.1實驗動物分組 將55只體質量180 g左右的雄性Wistar大鼠隨機分為以下5組：空白組（11只）、模型組（11只）、速效救心丸高劑量組（11只）、速效救心丸中劑量組（11只）、速效救心丸低劑量組（11只）。在造模過程中，因氣道管理不當，引起速效救心丸中劑量組死亡大鼠2只。故本課題分組情況為：空白組11只，模型組11只，速效救心丸高劑量組11只、速效救心丸中劑量組9只、速效救心丸低劑量組11只。每組各取3只大鼠石蠟切片。

2.2分組給藥 造模前，根據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”折算，速效救心丸高劑量為人常規劑量的兩倍，速效救心丸中劑量為人常規劑量，速效救心丸低劑量為人常規劑量的一半。藥物組按高、中、低劑量分別給予速效救心丸混懸劑1.28、0.64、0.32 g/kg灌胃，每日1次。空白組和模型組給予等量雙蒸水每日1次，定時灌胃。療程為一周。

2.3動物模型制備 參照文獻［7-8］，將方法略加改良，將大鼠稱定質量麻醉固定，暴露氣管，完成插管，呼吸機輔助呼吸，感受心尖搏動處，切開皮膚，鈍性分離胸部肌肉，打開胸腔，剪開心包，暴露心臟，在心臟表面動脈圓錐與左心耳交界稍下用無創傷縫線穿線結扎左冠狀動脈前降支，結扎部位塞入大小厚度合適的棉條，以防止損傷冠脈，結扎部位以下心肌變白，活動減弱，心電圖提示ST段抬高為缺血成功。結扎后30 min，打開縫線使血流再通30 min，測心電圖，ST段下降二分之一，發白部分心肌顏色變紅，為再通成功。取出心臟，于生理鹽水中洗去血污，去除左心室以外組織。

2.4觀測指標與檢測方法

2.4.1純化線粒體膜通道（MPTP）開放程度的測定 心肌線粒體提取成功后，立即用分光光度法檢測MPTP開放程度。步驟參照純化線粒體膜通道（MPTP）比色法檢測試劑盒。

2.4.2心肌組織細胞色素C水平的測定 采用大鼠細胞色素C（Cytochrome C，Cyt-C）ELISA試劑盒。

2.4.3HE染色 取部分心肌組織石蠟包埋、切片，HE染色觀察大鼠心肌形態變化。

2.4.4心肌細胞凋亡的測定 取部分心肌組織石蠟包埋、切片，具體步驟參照試劑盒。圖像分析采用Image-Pro軟件，每張片子在凋亡陽性區域隨機選取3個視野，計算每個視野內棕黃色染色區域的反應面積為陽性面積，取每組均值進行比較。

3　統計分析

4　結果

4.1速效救心丸對心肌組織MPTP的影響 使用CaCl2誘導MPTP的開放，引起A440處線粒體吸光度的降低。如圖1A所示：與空白組相比，模型組CaCl2誘導MPTP開放，線粒體腫脹，吸光度比值（A440/初始A440）隨著時間下降迅速；與模型組相比，速效救心丸高、中、低劑量組的心肌線粒體的吸光度比值下降緩慢；圖1B示30 min時吸光度的下降幅度（ΔA440），與空白組相比，模型組下降幅度較大，并與空白組存在統計學差異（P＜0.05）；與模型組相比，速效救心丸低、中、高劑量組下降幅度較低，但高劑量組與模型組之間存在統計學差異（P＜0.05）。

4.2速效救心丸對各組大鼠胞漿內細胞色素C表達的影響 與空白組相比，模型組Cyt-C的表達增加（P＜0.05）；與模型組相比，速效救心丸低、中劑量組Cyt-C的表達均有降低的趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）。與模型組相比，速效救心丸高劑量組Cyt-C的表達明顯降低（P＜0.01）。見表1。

4.3TUNEL法檢測細胞凋亡結果 空白組光鏡下可見少量凋亡陽性細胞，組織排列整齊嚴密。模型組可見細胞核固縮，核染色質邊集等凋亡特征，組織排列紊亂，凋亡陽性細胞多。與空白組對比，模型組與藥物組的陽性反應面積率升高（P＜0.01）。與模型組相比，藥物組的陽性反應面積率降低（P＜0.01）。速效救心丸低劑量組、中劑量組與速效高劑量組之間的陽性反應面積率無差異（P＞0.05），見表2。

圖1　速效救心丸對線粒體通透性轉換孔的影響Fig.1 Effect of Suxiao Jiuxin Pills on CaCl2-induced MPTP opening

表1　各組細胞色素C表達水平比較（±s，μg/g）Tab.1 Expression of Cyt-C in each group（±s，μg/g）

表1　各組細胞色素C表達水平比較（±s，μg/g）Tab.1 Expression of Cyt-C in each group（±s，μg/g）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）動物數細胞色素C表達量空白組8 391.38±47.90模型組8 471.66±43.69*速效救心丸低劑量0.32 8 422.57±76.17速效救心丸中劑量0.64 6 413.32±38.53速效救心丸高劑量1.28 8 348.42±43.41##

表2　各組心肌組織細胞凋亡TUNEL陽性面積率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate for each group as determ ined by TUNEL method（±s）

表2　各組心肌組織細胞凋亡TUNEL陽性面積率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate for each group as determ ined by TUNEL method（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別劑量/（g·kg-1）動物數陽性反應面積率空白組—3 0.98±0.34模型組—3 6.09±0.62**速效救心丸低劑量組0.32 3 3.34±0.20##**速效救心丸中劑量組0.64 3 3.46+0.21##**速效救心丸高劑量組1.28 3 3.26+0.37##**

4.4HE染色結果 通過HE染色進一步觀察心肌細胞的形態及炎性細胞浸潤的情況。空白組可見正常心肌細胞無水腫、肥大、變形和壞死，心肌纖維排列整齊清晰，細胞核無固縮，細胞膜完整。與空白組相比，模型組大鼠心肌纖維組織紊亂，部分溶解斷裂，間質內見水腫變性，細胞膜被破壞，細胞核固縮，細胞染色不均勻。速效救心丸低劑量組與模型組無太大差異。速效救心丸中劑量組及速效救心丸高劑量組心肌纖維斷裂溶解，間質內水腫情況較模型組減輕。見圖2。

圖2　各組心肌HE染色（×100）Fig.2 Morphological changes（HE staining×100）

5　討論

缺血性心臟病已成為全世界最主要的死亡原因之一。冠脈血運重建可以減少心肌的壞死面積，改善心功能，但是在血運重建的同時，常常伴有再灌注引起的心肌細胞進一步的壞死，心肌梗死面積增加，稱為心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）。

速效救心丸由川芎、冰片等藥物組成。川芎辛溫，歸肝膽心包經，《神農本草經》記載川芎能“主中風入腦頭痛、寒痹，筋脈緩急”，為臨床治療心脈瘀阻之胸痹心痛之要藥。冰片辛苦微寒，歸心脾肺經，《醫林纂要》記載冰片“性走而不守”，具有開竅醒神，通竅止痛的功效。臨床有實驗證明大劑量的速效救心丸能降低急診PTCA術后心律失常的發生率，尤其能減少再灌注后快速室性心律失常，降低惡性心律失常的致死率［9］，但具體機制不詳。

一些研究證實線粒體通透性與缺血/再灌注損傷相關［5，10-12］。線粒體通透性轉換現象主要是指位于線粒體內膜的轉換孔開放，以及隨之而來的離子平衡被打破，基質水腫和外膜破裂，激活相關的凋亡因子，從而介導細胞死亡。在缺血/再灌注、心肌梗死后、心肌重組和心衰等病理狀態下，細胞內鈣離子超載，氧化應激和ATP合成減少都可引起線粒體滲透性轉換孔的開放。根據外界刺激的嚴重程度，決定了MPTP的開放程度，進一步決定了細胞的死亡方式——壞死或者凋亡［13］。當外界刺激較重，線粒體上的MPTP持續性的不可逆的開放，線粒體去極化，大量離子涌入，基質水腫，外膜破裂，凋亡因子釋放，ATP耗竭，這種災難性的MPTP的開放將使細胞不可避免大量壞死。當外界刺激較輕時，一部分線粒體上的MPTP一過性的開放，線粒體去極化，基質水腫，凋亡因子釋放，ATP仍可由部分未受損的線粒體提供，但是這并不意味著細胞能避免死亡，線粒體還通過凋亡來介導細胞死亡。

在本實驗中，速效救心丸預處理的缺血再灌注大鼠心肌細胞相比模型組而言，線粒體通透性轉換孔（MPTP）的開放程度受到抑制，細胞色素C的表達水平下降，細胞凋亡水平降低。速效救心丸的低、中劑量組可以抑制MPTP開放，減少細胞色素C的表達，與模型組相比無統計學差異，而高劑量組與模型組相比存在統計學差異（P＜0.05和P＜0.01）。而速效救心丸高、中、低劑量組在細胞凋亡程度上無劑量依賴性。本實驗研究結果表明，速效救心丸通過抑制MPTP的開放，保護線粒體膜功能的完整性，減少細胞色素C的釋放，以達到降低缺血/再灌注后細胞凋亡程度，實現對心肌細胞的保護作用。

本實驗深入了解速效救心丸的心肌保護機制，為中醫藥臨床干預心肌缺血/再灌注損傷，提供一定的客觀依據。

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Suxiao Jiuxin Pills interfere MPTP and m yocardial cell apoptosis in rats with ischem ia-reperfusion injury

CHEN Ya-ni， GAO Jun-jie， ZHUWen-ye， CHEN Tie-jun， SHEN Zhi-jie， WANG Xiao-long*
（Cardioυascular Department of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIM To explore the interfering effectof Suxiao Jiuxin Pills（Chuanxiong Rhizoma，Borneolum syntheticum）on opening ofmitochondrial permeability transition pore（MPTP）andmyocardial cell apoptosis in ratswith ischemia-reperfusion injury.METHODS Fifty-five SPF level healthy male Wistar rats were randomly divided into five groups（eleven in each），the control group，the model group，the Suxiao Jiuxin Pills low，middle and high dosage groups（receiving Suxiao Jiuxin Pills）.The controlgroup and themodelgroup were treated with purewater.The leftanterior descending branches of ratswere ligatured to cause the ischemia-reperfusionmodel after seven-day treatment.The opening of mitochondrial permeability transition pore and the expression of cytochrome C（Cyt-C）were examined. TUNELmethod was used for cell apoptosis.HE staining for the observation ofmyocardial cellmorphology was carried out.RESULTS Compared with the control group，MPTP opening，Cyt-C and the rate of positive reactive area of TUNEL inmodel group were significantly higher（P＜0.05，P＜0.05，and P＜0.01，respectively）.The ratesof positive reactive area of TUNEL in Suxiao Jiuxin Pills groups（low，middle and high）were markedly lower than those in the model group（P＜0.01）without significant difference among groups.Moreover，the sizes of MPTP opening（P＜0.05）and the expression of Cyt-C（P＜0.01）in Suxiao Jiuxin Pills high dosage group were all lower than those of themodelgroup.CONCLUSION Suxiao Jiuxin Pills have certain protective effect in the treatment of myocardial ischemiareperfusion injury in rats and itsmechanism might be related to inhibitory effect of the MPTP opening.

Suxiao Jiuxin Pills；mitochondrial permeability transition pore（MPTP）；cell apoptosis；cytochrome C

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0469-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.001

2014-11-05

上海市衛生局科研基金項目（20114049）；上海市科委立項課題（12401903400）；上海市中醫臨床重點實驗室（14DZ2273200）；上海市中醫發展辦公室中西醫結合重點病種項目（ZXbz2012-08）

陳亞妮（1989—），女，碩士生，主要從事中西醫結合心血管病研究。Tel：13788985868，E-mail：458571422@qq.com

王肖龍（1965—），男，主任醫師，教授，碩士生導師，主要從事中西醫結合心血管病的防治研究。Tel：13501991450，E-mail：wxlqy0214@163.com