王永麗,李 鋒,喬維維,陳 肖,黃明明,黎良浩,章建浩,*
(1.南京農業大學食品科技學院,國家肉品質量與安全控制工程技術研究中心,江蘇 南京 210095;2.山東農業大學食品科學與工程學院,山東 泰安 271018)
姜辣素對培根風干成熟過程中微生物及生物胺形成的抑制效應
王永麗1,李 鋒2,喬維維1,陳 肖1,黃明明1,黎良浩1,章建浩1,*
(1.南京農業大學食品科技學院,國家肉品質量與安全控制工程技術研究中心,江蘇 南京 210095;2.山東農業大學食品科學與工程學院,山東 泰安 271018)
以五花肉為原料,腌制時添加不同含量(100、300、500 mg/kg)的姜辣素進行風干成熟,測定樣品理化指標、微生物及生物胺含量變化情況,研究姜辣素對培根風干成熟過程中微生物及生物胺形成的抑制效應。結果表明:與對照組相比,姜辣素能顯著抑制菌落總數和腸桿菌(P<0.05);在風干培根樣品中共檢測到腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺5 種生物胺;生物胺總量隨著風干時間的延長呈顯著增加趨勢(P<0.05),100、300、500 mg/kg處理組與對照組總生物胺含量存在顯著性差異(P<0.05)。300 mg/kg處理組總生物胺含量最低,為94.13 mg/kg,相對于對照組降低了34.56%,且此時腐胺、尸胺、酪胺、組胺和精胺含量也得到了很好的抑制,相對于對照組分別下降了26.60%、40.59%、37.08%、72.19%和23.59%。添加姜辣素能顯著降低樣品中揮發性鹽基氮含量(P<0.05),對于提高培根的品質及安全性具有較好的效果。
培根;腌制風干;姜辣素;生物胺;微生物
培根是歐美國家的一種重要腌臘肉制品,是豬肉經過腌制、煙熏成熟等工藝加工而成,在我國也有類似西式培根的腌臘肉產品,主要集中在我國西南地區。腌臘肉制品存在脂質過度氧化、微生物污染及有害成分含量高等問題而被消費者高度關注。肉制品中的生物胺主要由氨基酸在肌肉內源酶和微生物產生的外源酶催化下發生脫羧反應而產生,肉制品發生腐敗時其中的一些氨基酸脫羧酶陽性細菌會大量增殖,其產生的脫羧酶促進氨基酸脫羧,從而推動生物胺的大量積累[1]。當人體攝入過量的生物胺時,會引起頭疼、惡心、心悸、血壓變化和呼吸紊亂等過敏反應[2-3]。酪胺和組胺被認為是致突變劑的前體物,其他多聚胺類如腐胺、尸胺、精胺、亞精胺也會與某些亞硝基化合物反應產生致癌性的N-二甲基亞硝胺、N-亞硝基吡咯烷和N-亞硝基哌啶[4]。已有研究一般只考慮到組胺和酪胺具有毒性,但美國食品藥品監管局(US-Food and Drug Administration,US-FDA)的研究指出,一些生物胺如腐胺和尸胺單獨存在時也會導致人體的疾?。?]。
目前許多研究指出,天然植物提取物對生物胺的形成具有較好的抑制效果[6-7]。姜辣素是生姜中大量存在的具有辣味物質的總稱;姜酚是姜中主要活性成分,具有很強的抗氧化活性,其酚類結構和β-羥基酮結構能夠清除生物體中羥自由基和超氧陰離子自由基及降低脂質過氧化物。姜辣素的抗氧化能力優于VC和VE,并且具有一定的抑菌作用[8]。姜辣素還具有降低膽固醇、抗腫瘤、抗炎癥等作用[9],將姜辣素應用于培根,為降低風干發酵肉制品微生物活性,抑制生物胺積累,提高品質提供了可能。本實驗旨在研究姜辣素對培根風干成熟過程中微生物及生物胺的作用效果,以期為實際生產實踐提供理論依據。
1.1材料與試劑
新鮮五花肉,購于江蘇省食品集團有限公司。
姜辣素(總酚含量≥98%) 南京澤朗生物科技有限公司;平板計數瓊脂(plate count agar,PCA)、結晶紫中性紅葡萄糖瓊脂(violet red bile glucose agar,VRBGA) 北京陸橋技術有限責任公司;生物胺標準品:色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺和丹磺酰氯 美國Sigma公司;乙腈和丙酮為色譜純;氨水、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉和氯化鎂等為分析純。
1.2儀器與設備
Waters Alliance 2695液相色譜系統 美國Waters公司;Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 ?m) 美國Agilent公司;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SPX-250型恒溫恒濕箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;KH-400KDB型高功率數控超聲波清洗器、生化培養箱 昆山禾創超聲儀器有限公司;Allegra 64R型高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;IKAT18basic型高速分散機 德國IKA公司;DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;JA2203N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1干腌培根加工方法
將新鮮五花肉分割成20 cm×15 cm×5 cm長方塊,平均質量1.2 kg,在4 ℃條件下冷卻24 h。冷卻結束,從中隨機抽取12 塊作為對照組:用質量分數2%的食鹽在其表面擦涂,4 ℃、相對濕度85%~90%條件下腌制3 d 。腌制結束后將樣品轉移到控溫控濕培養箱中進行風干成熟,時間12 d,其間溫濕度程序為起始溫度13 ℃、環境相對濕度85%,然后隨著風干成熟時間的延長溫度每天升高1.5 ℃、相對濕度每天降低0.5%。其余肉塊隨機分成3 組,每組12 塊,每組在腌制階段分別用100、300、500 mg/kg的姜辣素均勻涂抹肉塊表面,腌制和風干成熟步驟同樣品對照。
在工藝過程中于主要工藝點(原料、腌制后、風干6 d和風干12 d)隨機抽取3 塊樣品,然后分別取等量表面和中間部位的肌肉將其切碎、混勻即為樣品,用不透光真空袋真空包裝,-40 ℃條件下冷藏備用。
1.3.2理化指標測定
水分含量參照ISO 1442:1997 Meat and Meat Products-Determination of Moisture Content方法進行測定[10]。
pH值測定:精確稱取10.0 g樣品于80 mL離心管中,然后加10 mL蒸餾水用高速分散機勻漿1 min,勻漿結束后立即用pH計測定勻漿物的pH值,每次測定重復3 次。
1.3.3揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVBN)含量測定
參照陳莎莎等[11]的方法并稍作修改。具體如下:稱取10.0 g樣品于250 mL具塞錐形瓶中,加入90 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液,漩渦振蕩2 min,4 000 r/min離心,取5 mL上清液與5 mL 10 g/L的氧化鎂懸濁液一并加入消化管中,進行測定。
1.3.4微生物測定
按照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行[12],稍作修改,稱取25 g樣品放入無菌培養皿中剪碎,倒入225 mL無菌生理鹽水中,200 r/min,搖勻20 min,再依次作各種稀釋度的溶液;菌落總數采用平板計數瓊脂培養計數,腸桿菌用結晶紫中性紅葡萄糖瓊脂培養計數,結果以lg(CFU/g)表示。
1.3.5生物胺含量測定
1.3.5.1標準溶液配制與柱前衍生
參照盧士玲[13]的方法并稍作修改。配制質量濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL的混合標準溶液,取1 mL標準品混合溶液,加入200 μL 2 mol/L NaOH使之呈堿性,再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進行緩沖,然后再加入2 mL的丹磺酰氯溶液(10 mg/mL溶于丙酮),在40 ℃、黑暗條件中反應45 min,然后加入100 μL的體積分數為25%的氨水以中止反應,靜置30 min后用乙腈定容至5 mL,然后用0.22 μm的濾膜過濾,用于分析檢測。
1.3.5.2樣品處理
取5 g絞碎樣品加入20 mL 0.4 mol/L的高氯酸(HClO4),徹底勻漿,然后于超聲波提取儀中超生提取30 min,冷凍離心機(4 ℃,3 000 r/min)離心10 min,沉淀部分如前述的方法再提取一遍。取兩次的上清液用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50 mL。取1 mL樣液按1.3.5.1節方法進行柱前衍生。
1.3.5.3色譜條件
色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速為1 mL/min,紫外檢測波長為254 nm,進樣量20 μL,柱溫35 ℃,流動相A為水,B為乙腈,采用梯度洗脫,洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program
1.4數據統計分析
利用Sigma Plot軟件作圖,用SAS 8.2統計軟件進行方差分析(ANOVA),不同平均值之間利用Fisher’s最小顯著差異法(least significant difference,LSD)進行差異顯著性檢驗。
2.1不同姜辣素添加量對加工過程中培根理化指標的影響


圖1 姜辣素不同添加量對風干培根加工過程中理化指標的影響Fig.1 Changes in physicochemical indices during dry-curing of bacons affected by adding different amounts of gingerol
由圖1a可知,水分含量在整個加工過程中呈下降趨勢,到風干成熟結束時對照樣品中的水分含量為45.3%,相比原料階段(73.6%)下降了38.5%。整個過程中,水分在腌制階段變化不顯著,在風干成熟階段顯著下降(P<0.05)。不同含量的姜辣素對水分含量變化的影響無顯著差異(P>0.05)。
由圖1b可知,pH值在整個加工過程呈上升趨勢,原料與終產品差異顯著(P<0.05)。在風干過程中腐敗微生物生長代謝的外源蛋白酶會產生氨基酸、揮發性含氮化合物等堿性物質,使產品pH值逐漸升高;風干中后期,各處理組pH值顯著低于對照組(P<0.05),說明姜辣素能抑制腐敗微生物繁殖,減少胺的積累。
由圖1c可知,TVBN含量隨風干成熟時間的延長顯著增加,與對照組相比,添加姜辣素可顯著降低培根在風干過程中TVBN的含量(P<0.05)。添加300 mg/kg姜辣素處理組樣品TVBN含量最低,風干12 d時為28.18 mg/100 g,相對于對照組(35.54 mg/100 g)降低了20.7%,當姜辣素添加量增加到500 mg/kg時,樣品中TVBN含量又出現上升的趨勢,但這兩個處理組差異不顯著(P>0.05)。TVBN是用于表征肉品腐敗程度最常用的指標,TVBN值越高,肉的新鮮度越差。豬肉中含有豐富的蛋白質,在風干成熟過程中由于微生物生長引起脫羧、脫氨作用,導致蛋白質分解,生成大量的多肽、游離氨基酸和TVBN等物質,從而造成培根的腐敗變質[14]。水分含量、pH值均會影響樣品TVBN含量,水分含量高,微生物的生理代謝旺盛,而低pH值會抑制微生物的新陳代謝[15],降低TVBN積累。
2.2不同姜辣素添加量對培根加工過程中微生物的影響

圖2 姜辣素不同添加量對風干培根加工過程中菌落總數的影響Fig.2 Changes in total plate count during dry-curing of bacons affected by adding different amounts of gingerol
由圖2可知,與對照組相比,在腌制和風干成熟前期(6 d),姜辣素能顯著降低菌落總數(P<0.05)。腌制后菌落總數呈下降趨勢,可能是由于氯化鈉改變了細胞膜滲透壓等環境因素,使水分活度降低,導致了微生物的新陳代謝減緩,從而抑制了大量微生物的繁殖[16]。在風干成熟階段,微生物數量均呈明顯的增加趨勢,此時姜辣素對微生物的抑制作用開始凸顯,且質量濃度越高,抑制作用越明顯。300 mg/kg與500 mg/kg添加量的抑菌作用顯著優于100 mg/kg,在風干12 d時,300 mg/kg與500 mg/kg的抑菌效果并無顯著差異(P>0.05)。趙晉[8]通過抑菌實驗表明,姜辣素能夠激活單核細胞的分泌功能,使溶菌酶大量釋放,水解細胞壁中的黏多糖使其死亡或裂解,起到抑菌作用,特別是對具有氨基酸脫酸酶活性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯。Bover-Cid等[17]報道,微生物數量在6~10(lg(CFU/g))就可認為是肉制品開始腐敗,風干結束對照組和300 mg/kg處理組菌落總數分別為5.43、4.58(lg(CFU/g)),均在此標準之下,可見姜辣素能顯著抑制微生物的繁殖,延長肉制品腐敗變質時間。

圖3 姜辣素不同添加量對風干培根加工過程中腸桿菌數的影響Fig.3 Changes in Enterobacteriaceae during dry-curing of bacons affected by adding different amounts of gingerol
由圖3可知,風干過程顯著影響腸桿菌的數量(P<0.05),原料中腸桿菌為3.0(lg(CFU/g)),腌制結束各處理組降低到2.0(lg(CFU/g))左右,在風干成熟過程中,腸桿菌數先顯著升高隨后降低。姜辣素對腸桿菌數的影響在風干后期(12 d)時與對菌落總數的影響有所不同,呈明顯的下降趨勢,可能是風干后期次生代謝產物積累,腸桿菌生長繁殖能力與培根基質之間達到平衡,并對水分活度的快速降低及pH值升高等因素影響更加敏感,使其他微生物成為優勢菌株。不同添加量的姜辣素對具有氨基酸脫羧酶陽性的腸桿菌均有不同程度的抑制作用,這種抑制作用可以減緩培根的pH值升高。在風干成熟結束,對照組和500 mg/kg處理組的腸桿菌數量分別為3.55、2.86 (lg(CFU/g))。de Mey等[18]指出,在發酵香腸中腸桿菌是生物胺累積的重要因素之一,大腸桿菌能在香腸生產的前期釋放脫羧酶,酶催化氨基酸脫羧產生生物胺。腌臘肉制品中含有豐富的蛋白質,是生物胺產生的前體物質,姜辣素抑制具有高氨基酸脫羧酶活性微生物的繁殖,目前研究表明,腸桿菌是產生尸胺、腐胺的主要微生物,一些大腸桿菌也能產生大量的組胺[19]。實驗結果表明,具有抗氧化活性的姜辣素能有效抑制培根中腸桿菌數量,減緩肉制品中化學物質氧化水解的速率,使生物胺前體物質氨基酸減少,從而抑制生物胺在肉制品加工和貯藏過程中的積累。
2.3不同姜辣素添加量對培根加工過程中生物胺含量的影響

圖4 生物胺混合標準溶液的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram for a standard mixture of biogenic amines
由圖4可知,標準溶液中各種生物胺分離效果較好。由表2可知,風干培根樣品中共檢測到5 種生物胺,分別為:腐胺、尸胺、組胺、酪胺和精胺。生物胺是一類具有由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化而形成的含氮脂肪族、芳香族或雜環類低分子質量有機化合物的總稱。一般來說,它們都是由相應的氨基酸脫羧而產生的,如組胺、酪胺、腐胺、尸胺和精胺分別是由組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸經酶解脫羧而生成[20]。
不同姜辣素添加量能有效地控制風干培根樣品中總生物胺的含量。風干過程對總生物胺含量有顯著影響(P<0.05),風干12 d時各處理組與對照組總生物胺含量存在顯著性差異(P<0.05),300 mg/kg添加量時總生物胺含量為94.13 mg/kg,相對于對照組降低了34.56%,為總生物胺含量最低的一組。風干培根樣品中各種生物胺的含量存在差異,5 種生物胺中含量最高的是精胺,酪胺、腐胺和尸胺次之,組胺含量最低。樣品中各種生物胺含量的不同可能是由于各類來源微生物產生的脫羧酶種類與數量不同以及樣品中內源酶與各種氨基酸組成比例不同所致。除尸胺外,其余4 種生物胺的含量均隨成熟時間的延長顯著增加。就其毒性而言,組胺的毒性最大,酪胺次之;二胺中的腐胺和尸胺會增強組胺和酪胺的毒性,精胺作為生理多胺,對生物體內的代謝具有機能性作用[21]。

表2 姜辣素不同添加量對風干培根加工過程中生物胺含量的影響Table2 Changes in biogenic amine contents during dry-cured processing of bacons affected by adding different amounts of gingerol
風干成熟過程顯著影響腐胺和尸胺含量(P<0.05),在原料肉中沒有檢測到尸胺,表明原料衛生狀況良好。風干成熟結束時,尸胺含量增加到13.45 mg/kg(對照)和5.01 mg/kg(100 mg/kg處理組),說明姜辣素有效抑制了尸胺的積累。風干成熟中后期腸桿菌數顯著降低,尸胺的含量也相應降低。尸胺通常被認為是有氨基酸脫羧酶陽性細菌-腸桿菌在肉品成熟發酵的過程中賴氨酸脫羧產生的[22]。在對照樣品中腐胺含量最高,300 mg/kg姜辣素處理組腐胺含量最低,分別是18.01 mg/kg和13.22 mg/kg。蛋白水解程度對生物胺的生成具有顯著性的影響,蛋白水解程度越高,生成的氨基酸量越大,即生物胺的前體物就越多[23]。姜辣素抑制腐敗微生物的繁殖,降低蛋白質的分解,因此腐胺的前體物質也降低。
組胺毒性最強,在原料和風干成熟前期各姜辣素處理組中均未檢測到組胺,可能是由于風干前期水分含量下降,水分活度降低,產胺菌在低水分活度下生長緩慢,內源酶活性降低,姜辣素的抑菌作用擾亂位于細胞膜上的微生物脫羧酶活性,抑制微生物組氨酸脫羧酶分泌,延緩組胺生成[24]。500 mg/kg姜辣素處理組顯著延緩酪胺生長,風干結束相對于對照組降低了41.87%。Latorre-Moratalla等[25]認為食品中酪胺含量應低于100 mg/kg,100~800 mg/kg被認為是有毒性的,在培根樣品中,酪胺含量顯著低于此水平。原料中精胺含量為38 mg/kg,在風干成熟階段有所增加,精胺本身對人體沒有毒性,但是它可以和亞硝酸鹽反應生成致癌物N-亞硝胺。
100 mg/kg姜辣素降低生物胺含量的作用均不如300 mg/kg與500 mg/kg明顯,300 mg/kg與500 mg/kg的組間差異不顯著。Maijala等[26]認為生物胺產量降低的最主要原因是低pH值的產生,較低的pH值實質上抑制了產生物胺脫羧酶陽性菌的活性,尤其是腸桿菌科的菌類,這與本實驗結果相一致,當姜辣素添加量為300 mg/kg時,培根的pH值最低為6.22,而此時的生物胺總量也最低。綜合腐胺、尸胺、組胺、酪胺及精胺的結果以及成本因素,300 mg/kg的添加量更適合應用于培根的生產。
不同姜辣素添加量對風干培根樣品中水分含量的影響顯著,能顯著降低pH值和TVBN值,有效抑制微生物的生長繁殖,各指標的變化均在可接受范圍內。在風干培根樣品中共檢測出5 種生物胺,添加姜辣素能顯著降低總生物胺含量(P<0.05),當添加量為300 mg/kg時,對樣品中TVBN和總生物胺含量的抑制率最高,分別為20.7%和34.56%,且對毒性相對較高的組胺和酪胺有較好的抑制效果;添加姜辣素(300、500 mg/kg)與對照組相比在沒有顯著降低感官品質的基礎上,降低了風干培根樣品的腐敗程度,提高了肉品食用安全水平。實驗選擇具有抗氧化活性的姜辣素為添加劑,研究微生物及生物胺在培根生產過程中的變化規律,綜合理化指標結果,選擇300 mg/kg添加量應用于實際生產,為工業化應用提供理論依據。
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Inhibition of Microorganism and Biogenic Amines Formation in Dry-Cured Bacons by Gingerol
WANG Yongli1, LI Feng2, QIAO Weiwei1, CHEN Xiao1,HUANG Mingming1, LI Lianghao1, ZHANG Jianhao1,*
(1. National Central of Meat Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China; 2. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)
Green bacon belly pieces were used to produce dry-cured bacons, and different concentrations of gingerol(100, 300, and 500 mg/kg) were added during the salting process. After curing and drying, the changes in physical and chemical indexes, microorganisms and biogenic amine content were analyzed to explore the inhibition of microorganism and biogenic amines in dry-cured bacons. The results showed that gingerol could significantly inhibit the total plate count and Enterobacteriaceae count as compared to the control group (P < 0.05). Five kinds of biogenic amines (putrescine,cadaverine, histamine, tyramine and spermine) were detected in dry-cured bacons. Total biogenic amines content increased significantly during the dry-ripening process (P < 0.05). Significant differences (P < 0.05) were observed in the treated groups as compared with the control group. The group treated with gingerol at 300 mg/kg had the lowest content of biogenic amines, which was 94.13 mg/kg and reduced by 34.56% compared with the control group. The contents of putrescine, cadaverine,tyramine, histamine and spermine were reduced by 26.60%, 40.59%, 37.08%, 72.19% and 23.59%, respectively, compared with control group, indicating a very effective inhibition. Adding gingerol could also reduced significantly the content of volatile base nitrogen in dry-cured bacon (P < 0.05), and was effective for improving the quality and safety of bacons.
bacons; curing and drying; gingerol; biogenic amines; microorganism
TS251.5
A
1002-6630(2015)03-0029-06
10.7506/spkx1002-6630-201503006
2014-04-22
“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD28B01);公益性行業(農業)科研專項(201303082-2);國家自然科學基金青年科學基金項目(31201417)
王永麗(1983—),女,博士研究生,研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail:lily8941@163.com
章建浩(1961—),男,教授,博士,研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail:nau_zjh@njau.edu.cn