響應面試驗優化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的酶法合成工藝

齊丹萍，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

響應面試驗優化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的酶法合成工藝

齊丹萍，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

以實驗室自制的單半乳糖基甘油和游離棕櫚酸為原料，在有機溶劑中以固定化脂肪酶Novozyme 435為催化劑，研究單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成條件。在單因素試驗的基礎上，以單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率為響應值，確定酶添加量、底物物質的量比和反應時間作為影響合成反應的主要因素，進行響應面優化試驗。獲得單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的最佳合成條件為：丙酮為反應溶劑，脂肪酶Novozyme 435添加量12.93 mg/mL、底物物質的量比（單半乳糖基甘油-棕櫚酸）1.00∶4.49、反應溫度55 ℃、反應時間27.60 h，此時單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率為90.17%。

單半乳糖基甘油棕櫚酸酯；酶法合成；丙酮；脂肪酶Novozyme 435；優化

甘油糖脂是細胞膜的重要成分［1］，廣泛存在于植物、微生物和動物的神經組織，具有抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抗菌［4］、抗病毒［5］、抗炎［6］等作用，在化妝品、生物醫藥、食品等方面有著廣泛的應用前景［7］。要深入研究甘油糖脂的生物活性構效關系及其作用機理，必須有大量結構單一的純品，但是市場售出的高純度甘油糖脂種類少、價格昂貴，天然提取的甘油糖脂數量有限，純度也難以滿足研究的需要。因此如何正確且高效地獲得所需要的甘油糖脂成為目前的研究熱點之一。

甘油糖脂的合成方法主要有化學合成和酶法合成。由于酯化反應可逆，加上糖分子和甘油分子上的羥基較多，導致化學合成條件差［8］，選擇性低，副產物多，難以應用在食品、醫藥等行業［9］。與化學合成法相比，酶催化合成具有反應條件溫和、效率高、選擇性強、副產物少等優勢［10］，且綠色環保，符合可持續發展的要求［11］。由于在非水相中合成糖酯可以增大底物的溶解性，抑制可逆的副反應，提高反應的立體選擇性，并消除產物和底物的抑制作用。近年來，越來越多的研究人員利用非水相環境酶法合成糖酯，合成糖酯中所用糖基的種類多為葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和木糖醇等，以半乳糖基甘油作為糖基的研究很少［12］。

本實驗以前期合成的單半乳糖基甘油［13］和棕櫚酸作為底物，對固定化脂肪酶Novozyme 435在有機溶劑中催化合成單半乳糖基甘油棕櫚酸酯進行研究。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法進行優化，以得到最大的產物轉化率，為其酶法生產合成提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

單半乳糖基甘油（純度＞95%）由本實驗室自制；棕櫚酸、丙酮（均為化學純） 上海凌峰化學試劑有限公司；4?型分子篩 國藥集團化學試劑有限公司；固定化脂肪酶Novozyme 435（Candida antarctica） 丹麥Novozyme酶制劑公司；其他試劑和有機溶劑均為化學純或分析純。

1.2儀器與設備

電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；SHZ-88A往復式水浴恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；1200高效液相色譜（high p erformance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；ELSD 2000蒸發光散射檢測器 美國Alltech公司。

1.3方法

1.3.1單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成

將一定量的單半乳糖基甘油、棕櫚酸、固定化脂肪酶Novozyme 435和5 mL丙酮置于30 mL具塞試管中，密封后放入55 ℃水浴振蕩器（轉速130 r/min）中反應3 h，加入4?型分子篩約170 mg繼續反應，反應一段時間后，過濾除掉反應液中的酶，取20 μL進行液相檢測。所有反應進行3 個平行實驗，最終取其平均值。

1.3.2單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的定量分析

反應結束后取20 μL反應液進行液相檢測。色譜柱為ZORBA SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫保持在30 ℃，流動相為甲醇-水（體積比95∶5），流速0.5 mL/min，洗脫時間為25 min。檢測器為蒸發光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD），漂移管溫度55 ℃，氣流量為2.0 L/min，增益值為1。

單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的定量采用外標法。標品由實驗室自制并進行分離純化制得，純度＞97%。將純品半乳糖基甘油棕櫚酸單酯和二酯溶解于一定量的色譜純甲醇中，配成一系列濃度的標準溶液，HPLC-ELSD檢測后（圖1），繪制ln（峰面積）-ln（單半乳糖基甘油棕櫚酸酯濃度）標準曲線，得到方程：y=1.648 7x+8.561 3（單半乳糖基甘油棕櫚酸單酯）和y=1.605 5x+6.453 6（單半乳糖基甘油棕櫚酸二酯）。根據標準曲線分別計算單酯和二酯物質的量，最終根據下式計算單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率：

圖1　單半乳糖基甘油棕櫚酸酯反應液（A）、單半乳糖基甘油棕櫚酸單酯（B）和單半乳糖基甘油棕櫚酸二酯（C）的HPLC圖譜PLCFig.1 HPLC profi les of palmitoyl-monogalactosylglycerol reaction mixture （A）， monopalmitoyl-monogalactosylglycerol （B） and dipalmitoylmonogalactosylglycerol （C）

1.3.3單因素試驗

選取反應溶劑（丙酮、正己烷、叔戊醇、叔丁醇、乙腈）、酶添加量（4～20 mg/mL）、底物物質的量比（單半乳糖基甘油-棕櫚酸1∶1～1∶6）、反應時間（5～84 h）和反應溫度（40～55 ℃）5個因素，研究不同因素對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響，從而確定各因素的最適范圍。

1.3.4響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，固定丙酮為反應溶劑，反應溫度55 ℃，根據中心組合設計原理，選擇酶添加量8～16 mg/mL、底物物質的量比1∶3～1∶5、反應時間18～30 h，以單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率為響應值進行響應面分析，試驗因素和水平見表1。

表 1 響應面試驗因素水平表Table 1 Levels and codes of variables used in the experimental design

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1反應溶劑種類的影響

合適的溶劑對于有機相中進行的脂肪酶催化合成反應必不可少。有機溶劑不僅會影響反應底物的溶解度［14］，從而影響酯化率，還影響脂肪酶的穩定性和催化活性［15］。有機溶劑可以直接破壞酶活性中心構型的氫鍵、疏水作用等而使酶失活，還可以作用于酶的水化層間接影響酶活性［16］。因此選擇一種合適的有機溶劑作為反應體系對酶促反應的順利進行起著至關重要的作用。不同的有機溶劑對同一個反應體系中的底物溶解度和脂肪酶活性產生的影響效果不同，由此導致在不同有機溶劑中脂肪酶催化合成的產物轉化率不同。本實驗分別以丙酮、正己烷、叔戊醇、叔丁醇和乙腈為反應溶劑，加入單半乳糖基甘油0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸0.2 mmol/5 mL、脂肪酶4 mg/mL，55 ℃水浴反應48 h，考察溶劑種類對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響，結果如圖2所示。

圖2　有機溶劑對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響Fig.2 Effect of organic solvents on palmitoyl-monogalactosylglycerol yield

從圖2可以看出，以乙腈為溶劑時產率最高，與其他溶劑體系有著顯著性差異（P＜0.05），其次是丙酮和叔丁醇體系，正己烷體系中產物的量最少。以乙腈為溶劑時產物的產率雖然最高，但是乙腈毒性較強，不允許應用于食品工業，而丙酮的沸點較低，易于產物分離，且被歐共體允許在食品或食品添加劑產業中應用［17］，安全性較高，故選用丙酮為單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的反應溶劑。

2.1.2酶添加量的影響

酶催化反應中，酶質量濃度的大小會影響反應進程的快慢，同時也會影響產物的轉化率。酶添加量對酯合成轉化率在一定條件和質量濃度范圍內影響顯著，但質量濃度過高會增加反應成本［18］。因此在一定范圍內增大酶的質量濃度，可以縮短達到相同轉化率所需的反應時間，提高轉化率。以丙酮為反應溶劑，單半乳糖基甘油添加量0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸添加量0.2 mmol/5 mL，分別添加不同質量濃度的脂肪酶Novozyme 435：4、8、12、14、20 mg/mL，55 ℃水浴中進行合成反應，48 h后考察不同酶添加量對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。

圖3　酶添加量對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on palmitoyl-monogalactosylglycerol yield

由圖3可知，隨著酶添加量的增多，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產量逐漸增高，在酶添加量為12 mg/mL時單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產量最高，之后產量降低并趨于平衡。主要是由于加酶添加量超過一定范圍后，底物的量相對不足，且酶添加量過多使酶發生聚集而不能與底物充分接觸，從而降低了酶的催化效率［19］。故選取12 mg/mL為最佳酶添加量。

2.1.3底物物質的量比的影響

脂肪酶催化的酯化反應中，為提高其中一種底物的轉化率，使反應向著正方向進行，通常要增大另一種底物的量或在反應中不斷除去某種反應產物［20］。本實驗固定單半乳糖基甘油物質的量為0.1 mmol，分別在5 mL溶劑中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol棕櫚酸，酶添加量12 mg/mL，55 ℃水浴反應48 h，考察底物物質的量比對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。

圖4　底物物質的量比對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響Fig.4 Effect of molar ratio between substrates on palmitoylmonogalactosylglycerol yield

從圖4可以看出，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率隨底物物質的量比的變化先升后降。當單半乳糖基甘油與棕櫚酸的物質的量比在1∶1～1∶4范圍內時，底物的酯化產率隨之提高，底物物質的量比為1∶4時產率達到最高。繼續增加棕櫚酸的濃度，產率不升反降，可能原因是游離棕櫚酸濃度過高，與產物混合增加了反應體系的黏度，反應體系的傳質阻力增大，從而抑制反應的進行，造成原料的浪費［21］。因此實驗選取1∶4為最佳的底物物質的量比。

2.1.4反應時間的影響

在一定范圍內延長反應時間可以促進底物的擴散和產物的合成，但當反應達到平衡狀態之后，繼續延長反應時間也不會進一步提高產物的轉化率。本實驗固定單半乳糖基甘油添加量0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸添加量0.4 mmol/5 mL、脂肪酶添加量12 mg/mL，55 ℃水浴中進行合成反應，分別在5、12、24、36、48、60、72、84 h時取樣檢測，探討反應時間對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。

圖5　反應時間對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的影響Fig.5 Effect of reaction time on palmitoyl-galactosylglycerol yield

從圖5可以看出，隨著反應時間的延長，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產量呈上升趨勢，在24 h時達到最大值并趨于平穩。繼續延長反應時間，超過60 h后產量開始降低，分析原因可能是經過一段時間的反應后，催化劑活性開始下降［22］，另一方面，酯化反應存在逆反應，隨著反應的長時間進行，反應生成的酯可能被降解［23］。因此，選取24 h為適宜反應時間。

2.1.5反應溫度的影響

在酶促反應過程中，適宜的溫度是反應的一個關鍵因素。一般情況下，隨著溫度的升高，反應速率加快，但溫度超過酶的最適溫度后，酶的空間結構和構象會受到影響，從而降低酶活和酶的使用壽命［24］。由于反應溶劑丙酮的沸點為56.53 ℃，反應溫度超過56 ℃會導致溶劑揮發，影響反應進行，故實驗選取的最高溫度為55 ℃。本實驗固定單半乳糖基甘油添加量0.1 mmol/5 mL、棕櫚酸添加量0.4 mmol/5 mL、脂肪酶添加量12 mg/mL、反應時間24 h，分別在40、45、50、53、55 ℃條件下利用脂肪酶催化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成，探討反應溫度對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。

圖6　反應溫度對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on palmitoylmonogalactosylglycerol yield

從圖6可以看出，隨著反應溫度的不斷升高，產物的產率也不斷升高，在反應溫度為55 ℃時達到最大值，再繼續升高溫度反應溶劑就會揮發，影響反應的正常進行。此外，溫度過高還會導致酶活力下降，不利于酯化反應進行［17］。故選取55 ℃為適宜反應溫度，此時單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率為89.06%。

2.2響應面試驗優化

2.2.1響應面試驗結果

在單因素試驗基礎上，選擇酶添加量、底物物質的量比和反應時間進行三因素三水平的中心組合設計，共20 組試驗。試驗設計和結果如表2所示。

表2　響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

應用Design-Expert 8.0軟件對表2中數據進行多元回歸擬合，確定了單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率（Y）的最佳擬合二次回歸方程：

2.2.2模型擬合檢驗及方差分析

由表3可知，本實驗選用的模型回歸方程P值小于0.000 1，說明回歸方程極顯著，且失擬項不顯著（P=0.065 1＞0.05）。模型的相關系數（R2）為0.965 8，表明觀察值與預測值之間相關性較好。變異系數表明不同實驗組之間的變異程度，本試驗的變異系數為2.97%，處于較低水平，說明試驗的重復性較好。由上述分析可知，該模型與試驗情況擬合較好，可以在模型設定的范圍內分析和預測單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產率。回歸方程中底物物質的量比（B）對模型的影響極顯著（P＜0.000 1），反應時間（C）對模型的影響極顯著（P＜0.01）；此外，A2、B2和C2對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產率也有極顯著影響（P＜0.01）；酶添加量與反應時間的交互作用（AC）極顯著（P＜0.01）。

表3　單半乳糖基甘油棕櫚酸酯轉化率二項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance （ANOVA） for the experimental results of central composite design （CCD） （palmitoyl-galactosylglycerol yield）

2.2.3響應面分析

圖7為脂肪酶催化單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成的響應面，直觀反映了3個因素兩兩之間的交互作用對響應值單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。對其響應面曲面以及等高線圖進行分析可直觀看出最佳范圍，并可以在最佳范圍內根據單半乳糖基甘油棕櫚酸酯合成過程中的實際需要調整各因素大小，從而得到較高的產率。

圖7　各因素交互影響單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的響應面Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects on independent variables the yield of palmitoyl-monogalactosylglycerol

從圖7a可以看出，反應時間固定為24 h時，響應面的坡度較平緩，表明響應值（單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率）對酶添加量和底物物質的量比的交互作用不敏感。從等高線可以看出，酶添加量的變化對響應值的影響比底物物質的量比的變化影響大，等高線較密。隨著酶添加量的增加，產率不斷升高，達到一定值后開始下降，在底物物質的量比達到較高水平時，產率趨于平衡。可能原因是當底物物質的量比率比較低時，底物量不足，脂肪酶的活性位點沒有被完全結合，造成酶的浪費。底物物質的量比率達到一定范圍后，酶的結合位點達到飽和，繼續增加底物反而會造成浪費。圖7b顯示了底物物質的量比為1∶4時，加酶添加量和反應時間的交互作用對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。從圖7b中可以看出，響應面的坡度較陡，表明響應值對酶添加量和反應時間的交互作用敏感。等高線圖反映了酶添加量和反應時間的變化對響應值的影響不大。酶添加量較低時，反應時間的延長對產率的影響不大，當酶添加量在較高水平時，隨著反應時間的延長產率不斷升高，并在27 h時達到平衡，可能是酶添加量已經達到飽和的緣故。圖7c顯示了在酶添加量為12 mg/mL的條件下，底物物質的量比和反應時間的交互作用對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。從圖7c可以看出，響應面的坡度較平緩，表明響應值對酶添加量和底物物質的量比的交互作用不敏感。從等高線可以看出，底物物質的量比和反應時間的變化對響應值的影響不大。反應開始時，隨著反應時間的延長，增大底物物質的量比會使產物產率呈上升趨勢，繼續增大底物物質的量比率，底物已經達到飽和狀態，反應趨于平衡，過高的底物物質的量比率反而會造成反應的抑制和原料的浪費。

2.2.4最優反應條件的確定及模型驗證

在選取的各因素范圍內，利用Design-Expert統計分析軟件，根據回歸模型分析，得出丙酮中脂肪酶Novozyme 435催化合成單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的最佳反應條件，當酶添加量12.93 mg/mL、底物物質的量比1.00∶4.49、55 ℃水浴反應27.60 h時，單半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產率可達到90.18%。采用上述最佳反應條件，進行3次合成反應實驗，得到的實際平均產率為90.17%，與模型預測值基本一致，說明預測值與實際值之間有較好的擬合性，模型可信度高。

3　結 論

3本實驗采用實驗室自制的單半乳糖基甘油和棕櫚酸為原料，在丙酮體系中，以固定化脂肪酶Novozyme 435為催化劑，通過酯化反應合成單半乳糖基甘油棕櫚酸酯，確定了反應溶劑、酶添加量、底物物質的量比、反應時間和反應溫度等因素對單半乳糖基甘油棕櫚酸酯產率的影響。在此基礎上，通過響應面法建立了其統計學優化模型，并獲得了適宜的酶催化合成條件。驗證實驗的結果（90.17%）與模型預測值（90.18%）完全吻合，因此該實驗中所建立的模型具有實際應用價值。

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Response Surface Optimization of Lipase-Catalyzed Synthesis of Palmitoyl-Monogalactosylglycerol in Organic Solvent

QI Danping， DIAO Mingming， LU Zhaoxin， Lü Fengxia， BIE Xiaomei， ZHANG Chong， ZHAO Haizhen*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

The enzymatic synthesis of palmitoyl-monogalactosylglycerol from monogalactosyl glycerol and free palmitic acid in organic solvent was investigated in present study. Novozyme 435， an immobilized lipase， was used as catalyst. The main factors that influence the yield of palmitoyl-monogalactosylglycerol， including lipase amount， and molar ratio of monogalactosyl glycerol to palmitic acid and reaction time， were selected and optimized by the combined use of single factor experiments and response surface methodology. The optimal synthesis conditions were determined as follows： reaction solvent， acetone； Novozyme 435 amount， 12.93 mg/mL； molar ratio monogalactosylglycero to palmitic acid， 1.00：4.49； reaction temperature， 55 ℃； and reaction time， 27.60 h. Under these conditions， the yield of palmitoylmonogalactosylglycerol was 90.17%.

palmitoyl-monogalactosylglycerol； enzymatic synthesis； acetone； Novozyme 435； optimization

TS202.3

A

1002-6630（2015）18-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201518001

2015-02-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301558）；中央高校基本科研業務費專項（KJQN201427）

齊丹萍（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：2013108027@njau.edu.cn

趙海珍（1975—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn