鮮切水芹貯藏期間微生物生長模型及貨架期預測

田夢琦，楊潤強，莊 言，顧振新

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

鮮切水芹貯藏期間微生物生長模型及貨架期預測

田夢琦，楊潤強，莊 言，顧振新*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

利用選擇性培養基進行鮮切水芹貯藏期菌相分析，發現假單胞菌屬是其貯藏期優勢菌。保鮮袋挽口包裝的鮮切水芹在22 ℃貯藏8 d，假單胞菌數量即達到106CFU/g，低溫貯藏有助于抑制假單胞菌的生長繁殖。修正的Gompertz模型能有效地擬合出4 ℃和22 ℃條件下假單胞菌屬細菌的動態變化，偏差度和準確度分析表明所建立的模型是有效的。鮮切水芹于低溫貯藏3 d后置于常溫（22 ± 1） ℃貯藏時，葉綠素和木質素動態變化符合一級模型，在實際應用中，可根據腐敗菌的生長速率來預測鮮切水芹的貨架期。

鮮切水芹；貯藏；微生物；貨架期

新鮮蔬菜經過切割后，大量的營養物質外流，增加了微生物侵染機會，導致品質下降，貨架期縮短。引起新鮮蔬菜及其鮮切產品腐爛變質的微生物主要為細菌和霉菌［1］。常見的細菌有假單胞菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬等，不同蔬菜上的細菌群落差別很大。

近年來，國內外大量研究了微生物預測模型在食品質量控制中的應用。Jacxsens等［2］把預測模型應用于檢測溫度變化對氣調平衡包裝鮮切蔬菜的微生物特性和感官特性的影響，認為貯藏溫度的控制是其中最重要的因素。Pirovani等［3］建立了新鮮菠菜在清洗過程中有效氯的消耗和微生物總菌數減少情況的預測模型。Koseki等［4］用預測模型評估1～10 ℃條件下新鮮萵苣和甘藍的微生物生長情況，建立了最適合的Gompertz函數模型。國內眾多學者也分別建立了鮮切生菜［5］、蘋果［6］、蓮藕［7］等在貯藏期間的微生物生長模型，但關于水芹的微生物生長模型暫未報道。

食品貨架期是指食品被貯藏在推薦的條件下，能夠保持安全與理想的感官、理化和微生物特性及保留標簽聲明的營養值的時間［8］。對食品貨架壽命終點的評價必須綜合考慮包括微生物、質地、感官、營養成分等變化。采后水芹含水量高、代謝旺盛、質地脆嫩、極易遭受機械損傷導致褐變、脫綠、黃化等，組織迅速失水萎縮、木質化，而水芹鮮切的過程增加了微生物接觸的機會，易于腐爛。因此，鮮切水芹貨架期評估需綜合考量其理化、微生物和感官指標。

針對鮮切水芹存在的微生物污染風險，本實驗研究了培養基對引起鮮切水芹各菌屬菌相變化情況，確定了優勢菌，探討了在低溫和常溫貯藏條件下鮮切水芹優勢菌菌落數隨貯藏期的動態變化，建立了相應的Gompertz函數模型；以鮮切水芹在低溫貯藏3 d后放置在常溫條件下銷售為例，研究其葉綠素與木質素含量、優勢菌數、感官質量的動力學，據此建立了鮮切水芹貨架期預測模型，為鮮切水芹的貯藏與流通提供了理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

水芹，品種為大圣長白水芹，產自南京市六合區大圣村，帶根采收，采后立即運回實驗室。挑選鮮綠、干凈、無機械損傷、無病蟲害、大小粗細和長度基本一致的水芹備用。

胰蛋白胨、營養瓊脂、酵母浸粉、葡萄糖、NaCl、吐溫 國藥集團上海化學試劑廠；假單胞分離瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBGA、甘露醇高鹽瓊脂、孟加拉紅培養基、腸球菌培養基 青島高科技園海博生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

DHG-9030A鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；FA/JA電子天平 上海精密科學儀器有限公司；KQ-250DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；恒溫培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.3方法

1.3.1微生物菌群分析

隨機取300 g水芹，切成25 cm鮮切段，用打有5孔的聚乙烯復合保鮮袋挽口包裝后于常溫（22±1）℃貯藏10 d，每隔2 d考察各菌屬菌落數。

1.3.2優勢腐敗菌生長預測模型建立

隨機取2 組水芹，每組300 g，均切成25 cm鮮切段，用打有5孔的聚乙烯復合保鮮袋挽口包裝后于低溫（4 ± 1）℃和常溫（22 ± 1） ℃貯藏。每隔1 d測定優勢菌菌落數，每處理重復3 次。之后，采用Matlab軟件建立Gompertz函數模型。

1.3.3貨架期預測模型

以鮮切水芹在低溫貯藏3 d后置于常溫（22 ± 1） ℃銷售為例，測定其葉綠素含量、木質素含量、優勢菌數和感官質量的動力學，并建立相關數學模型。之后，基于此4 個指標模型分別建立了鮮切水芹在設定的模擬流通環節下的貨架期預測模型。

1.3.4指標測定

1.3.4.1水芹微生物分離

無菌操作條件下取水芹10 g，放入裝有 225 mL無菌生理鹽水和適量無菌玻璃珠的錐形瓶中均質，吸取1 mL 懸液進行稀釋，每種選擇性培養基取3 個合適的稀釋梯度倒平板。培養基和培養條件見表1。

表1　水芹中各種菌的選擇性培養基及培養條件Table 1 Selective medium and culture conditions for all species of bacteria from cress

1.3.4.2水芹貯藏期間菌相變化規律

采用選擇性培養基對水芹于22 ℃貯藏10 d內菌落總數、假單胞菌屬、腸桿菌科、腸球菌、葡萄球菌以及霉菌和酵母菌進行平板計數，微生物培養條件同表1。

1.3.4.3優勢菌菌落數

參照GB/T 5009.1—2003《食品衛生檢驗方法》中倒平板法測定。

1.3.4.4優勢菌生長模型的建立

應用修正的Gompertz模型［9］對鮮切水芹優勢菌的生長曲線進行擬合，估計生長曲線的最大比生長速率和遲滯時間。

式中：t為時間；Nt為t時的菌數/（CFU/g）；Nmax、N0分別為最大和初始菌數/（CFU/g）；e為常數2.718；μmax為微生物生長的最大比生長速率/d-1；λ為微生物生長的延滯時間/d。

應用Excel 2003統計所有數據，用Matlab軟件對上述的Gompertz方程進行擬合，并繪圖建立生長模型。

1.3.4.5優勢菌生長模型的可靠性評價

用準確度（accuracy factor，Af）和偏差度（bias factor，Bf）來判定模型精確度［10］。將優勢菌生長動力學模型求得的預測值與實驗所得的數值代入式（2）、（3）求得Af與Bf。

式（2）、（3）中：Npredicted為預測值；Nobserved為實測值；n為實驗次數。Bf在0.90～1.05間表明模型準確因子高，誤差小；在0.70～0.90及1.06～1.15間表明模型精確度可接受，但誤差較大；小于0.70或大于1.15表明模型不可靠，不能用于模擬描述微生物生長等狀況。

1.3.4.6貨架期預測模型的建立

鮮切水芹低溫冷藏3 d后，測定其葉綠素、木質素、優勢菌數和感官質量作為常溫貨架期預測的初始值。之后，測定常溫貯藏10 d內上述4 項指標的動力學，并建立相關數學模型。基于該數學模型，可獲得鮮切水芹在設定的模擬流通環境下的貨架期預測模型。

1.3.4.7感官評定

參考數字化評分方法［5，11］進行評定，根據水芹可食莖特點，具體評分指標見表2，評分時按加權系數，色澤50%，質地50%。5 分以下為感官拒絕，不可接受。

表2　感官評定評分表Table 2 Criteria for sensory evaluation of fresh-cut cress

1.3.4.8葉綠素和木質素含量測定

參照文獻［12］方法，將25 cm長鮮切水芹切成1 cm長小段，充分混勻。隨機稱取5 g樣品剪碎，放入研缽中，加入0.2 g碳酸鈣粉末及2 mL 95%乙醇溶液研磨，再加95%乙醇溶液3 mL繼續研磨至組織變白，靜置5 min。將勻漿液過濾到25 mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇溶液沖洗研缽、研棒及殘渣數次，一起過濾至容量瓶中。用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠素全部洗入容量瓶，直至濾紙無色，定容至刻度。以95%乙醇溶液為空白，分別在波長665 nm和649 nm處讀取吸光度。葉綠素含量C按式（4）計算：

參照Luo等［13］方法并略作修改。將25 cm長鮮切水芹切成1 cm長小段，混勻，于50 ℃烘干至恒質量后粉碎，稱取水芹干粉末0.1 g（m1）放入研缽，加入4 mL 72% H2SO4溶液攪拌至無塊狀，室溫靜置4 h后將混合液轉移至250 mL平底燒瓶中，加入蒸餾水153 mL，將燒瓶放置在電爐上冷凝回流煮沸2 h。用已恒質量（m2）的濾紙抽濾，再將盛有木質素的濾紙于60 ℃烘至恒質量，取出稱質量（m3），計算公式見式（5）：

1.4數據統計與分析

2　結果與分析

2.1水芹中微生物組分初步分析及優勢菌的確定

2.1.1水芹中微生物的初步分析

圖1　鮮切水芹各菌屬平板菌落生長情況Fig.1 The growth of each microfl ora colony from cress on agar plates

由圖1可知，鮮切水芹中的常規微生物種類有霉菌、酵母菌、腸桿菌屬、假單胞菌屬和葡萄球菌屬，這些均是國標中規定的常規檢測微生物種類，腸球菌選擇性培養基上未長出腸球菌菌落。

2.1.2水芹貯藏期間菌相變化規律

圖2　鮮切水芹22 ℃貯藏期間菌相變化Fig.2 Effect of storage time on the microflora of fresh-cut cress stored at 22 ℃

由圖2可知，水芹貯藏期間菌落總數、霉菌和酵母菌、葡萄球菌屬和腸桿菌屬菌落數均隨貯藏時間延長先上升后平穩，呈類“S”型曲線；而假單胞菌屬數在貯藏前8 d逐漸增加，然后略有下降，而霉菌和酵母菌以及腸桿菌數量處于急劇增加的時期。貯藏前8 d，假單胞菌屬的數量和生長趨勢最接近菌落總數，是該時間段的優勢菌；霉菌和酵母菌在貯藏8 d后競爭性較強，假單胞菌則處于生長劣勢。貯藏8 d時，鮮切水芹出現明顯的肉眼可見的腐爛和褐變。綜合考慮，確定假單胞菌屬作為鮮切水芹貯藏期的優勢腐敗菌。

2.2不同貯藏溫度條件下水芹假單胞菌屬生長模型

2.2.1模型的建立

圖3　4 ℃貯藏鮮切水芹假單胞菌屬生長擬合曲線Fig.3 The growth curve of Pseudomonas in fresh-cut cress stored at 4 ℃

圖4　22 ℃貯藏鮮切水芹假單胞菌屬生長擬合曲線Fig.4 The growth curve of Pseudomonas in fresh-cut cress stored at 22 ℃

貯藏溫度對鮮切水芹假單胞菌屬數量影響顯著，4 ℃條件下水芹貯藏20 d后假單胞菌屬數量才達到106的數量級，在貯藏前17 d，其數量均小于106CFU/g（圖3）；在22 ℃條件下貯藏時，假單胞菌屬數量短時間內急劇增長，貯藏7 d后便超過106CFU/g（圖4）。可見，低溫貯藏有助于抑制假單胞菌的生長繁殖，對應的生長曲線擬合方程4 ℃見式（6），22 ℃見式（7）：

表3　4 ℃和22 ℃貯藏期間鮮切水芹假單胞菌生長動力學參數Table 3 The growth parameters of Pseudomonas obtained from Gompertz function

2個貯藏溫度條件下假單胞菌的生長曲線參數如表3所示，貯藏溫度越高，假單胞菌的最大比生長速率μ（d-1）越大，22 ℃是4 ℃的1.94 倍；生長的延滯時間λ隨溫度升高而縮短，4 ℃條件下的延滯時間為6.55 d，而22 ℃為0.78 d。

2.2.2模型的可靠性評價

表4　生長曲線模型的Af和BfTabllee4 Af aanndd Bf value of the growth curve model

由表4可知，實測值與預測值基本吻合，4 ℃貯藏的模型Af和Bf分別為1.039和0.990；22 ℃的模型Af和Bf分別為1.036和0.972，表明建立的Gompertz數學模型能有效預測鮮切水芹在4 ℃和22 ℃貯藏時假單胞菌屬的生長動態。

2.3鮮切水芹貨架期預測模型

以鮮切水芹在低溫（4 ℃）貯藏3 d后放置在常溫（22 ℃）銷售為例，測定其葉綠素含量、木質素含量、優勢菌數、感官質量的動力學變化，據此分別建立鮮切水芹貨架期預測模型。先測定低溫放置3 d后的水芹葉綠素含量、木質素含量、優勢菌數和感官質量，此為模擬流通常溫銷售下的初始值，即貨架期考察第0天的值，在此基礎上建立4 個指標對應的動力學模型。

食品的品質與時間關系通常表現出零級模型或一級模型，見式（8）：

式中：At為果蔬在任意時刻的品質；A0為果蔬的初始品質（t=0）；k為與溫度有關的品質變化常數；t為貯藏時間。

2.3.1葉綠素動力學模型

圖5　22 ℃貯藏鮮切水芹葉綠素動力學零級（A）和一級（B）模型Fig.5 Zero- and fi rst-order kinetic models of chlorophyll changes of fresh-cut cress stored at 22 ℃

由圖5可知，零級模型的回歸決定系數R2為0.983 9，一級模型的R2為0.985 7，2 個值均大于0.98，可見2 個模型均具有很高的擬合精度，即實測值和預測值有很高的一致性。由于一級模型R2大于零級模型R2，故采用一級模型擬合葉綠素的變化更佳，即lnAt= 0.799-0.119 5t，式中：At為不同時間t時水芹的葉綠素含量。則常溫銷售下鮮切水芹葉綠素含量C（mg/g）隨貯藏時間t變化的預測模型為C = e（0.799-0.1195t）。

2.3.2木質素動力學模型

圖6　22 ℃貯藏鮮切水芹木質素動力學零級（A）和一級（B）模型Fig.6 Zero- and fi rst-order kinetic models of lignin change of fresh-cut cress stored at 22 ℃

由圖6可知，零級模型的回歸決定系數R2為0.970 4，一級模型的R2為0.982 9，2 個值均大于0.97，可見2 個模型均具有很高的擬合精度，即實測值和預測值有很高的一致性。由于一級模型R2大于零級模型R2，故采用一級模型擬合木質素的變化更佳，即lnAt=2.702 5+0.051 9t，式中：At為不同時間t時水芹的木質素含量。則常溫銷售下鮮切水芹木質素含量L（%）隨貯藏時間t變化的預測模型為L=e（2.7025+0.0519t）。

2.3.3感官質量動力學模型

圖7 22 ℃貯藏鮮切水芹感官質量動力學零級（A）和一級（B）模型Fig.7 Zero- and fi rst-order kinetic models of sensory quality change of fresh-cut cress stored at 22 ℃

圖7顯示，零級模型的回歸決定系數R2為0.990 8，一級模型的R2為0.985，2 個值均大于0.98，可見2 個模型均具有很高的擬合精度，即實測值和預測值有很高的一致性。由于零級模型R2大于一級模型R2，故采用零級模型擬合感官質量的變化更佳，即At=-0.046 5t2-0.444t+ 9.829 1，式中：At為不同時間t時水芹的感官質量SQ，則常溫銷售條件下鮮切水芹感官質量SQ （10 分制）隨貯藏時間t（d）變化的預測模型為SQ =-0.046 5t2-0.444t+9.829 1。

2.3.4假單胞菌屬動力學模型

對于優勢菌假單胞菌屬，由圖3可知，鮮切水芹低溫放置3 d后，假單胞菌屬數量無顯著變化，與圖4常溫貯藏水芹假單胞菌屬數量初始值一致，故放置在常溫銷售的鮮切水芹假單胞菌屬動力學模型可采用常溫貯藏時假單胞菌的Gompertz生長模型，見式（9）：

2.3.5模擬商業流通條件下鮮切水芹貨架期預測

表5　模擬商業流通條件下鮮切水芹貨架期預測Table 5 The shelf-life prediction models of fresh-cut cress under commercial circulation conditions

由鮮切水芹葉綠素含量、木質素含量、感官質量和優勢菌的動力學模型計算出的對應的貨架期t，見表5。由于目前水芹產品缺乏相應國標或行業標準，故可以根據消費者對產品的感官評價或品質要求，如葉綠素含量、木質化程度等來獲得一個臨界值，將這個臨界值代入相應指標的貨架期預測模型中可以推算出對應的貨架期。另外，根據優勢菌數量要求，也可以推算出貨架期。為了更直接地表述該預測模型下得到的實際貨架期，參考葉綠素和木質素在（22±1）℃貯藏第10天時的值作為臨界值，以推算出鮮切水芹在模擬商業流通下對應的貨架期（表5）。感官評價在5 分以下時為“不可接受”。但在實際應用中，可根據腐敗菌的生長速率來預測鮮切水芹的貨架期。

3　討論與結論

新鮮蔬菜經切割后，組織結構被破壞，導致營養液外流、自然抵抗力降低，切分表面不僅為微生物的侵染創造了環境，還為微生物提供了充足的水分和營養。因此，微生物污染是引起鮮切蔬菜品質劣變和腐敗的主要因子［14］。研究表明，真空包裝的鮮切蓮藕于4 ℃貯藏10 d后，優勢腐敗菌總數增加到107CFU/g［15］；鮮切甘藍10 ℃貯藏7 d后，細菌總數也從104CFU/g升高到108CFU/g［16］。本研究中，保鮮袋挽口包裝的鮮切水芹在22 ℃貯藏7 d后，細菌總數即從103CFU/g上升到106CFU/g，這個升高幅度顯著低于10 ℃貯藏的鮮切甘藍，這主要與蔬菜種類和貯藏環境有關。這些結果均表明，鮮切蔬菜貯藏期間微生物生長繁殖旺盛。

鮮切蔬菜表面的微生物數量通常在103～106CFU/g之間［17］，迄今已分離鑒定出的微生物種類主要是假單胞菌屬、歐文氏菌屬、腸桿菌屬、乳酸菌屬等，也有一定量的霉菌和酵母菌，不同種類和品種的蔬菜中主要的污染微生物種類及數量差異較大。研究發現，假單胞菌屬在污染蔬菜的微生物中占50%～90%［18］。本研究鮮切水芹中的優勢菌是假單胞菌屬，水芹22 ℃貯藏8 d后，其含量突破106CFU/g，鮮切紫甘藍和西蘭花中的主要腐敗菌也是假單胞菌屬，占其總菌數的70%左右［19］。然而，Tournas［20］分析出酵母菌是華盛頓地區39種鮮切蔬菜中的主要微生物，數量最高達到4.0×108CFU/g。假單胞菌屬是一類專性需氧的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌，呈桿狀或略彎，具端鞭毛，能運動，不發酵糖類，通常最適生長溫度為30 ℃左右。假單胞菌在低溫條件下也能生長，能分泌果膠酶，降解果膠，從而破壞細胞組織，危害冷藏的果蔬［21］。

目前，國內外對微生物預測模型在鮮切果蔬質量控制中的應用進行了大量的研究。劉新有等［22］在實驗中建立的Gomperts模型能有效擬合不同貯藏溫度條件下鮮切蘋果中菌落總數的動態變化，從而能預測不同貯藏溫度及時間內鮮切蘋果中的菌落總數。Corbo等［23］認為Gomperts數學模型能很好地擬合鮮切梨中酵母菌、乳酸菌在4、8、12、20 ℃的生長規律。有學者比較了Gompertz、Richards、Stannard、Schnute、Logistic等模型在擬合微生物生長“S”型曲線上的應用效果，發現只有修改后的Gompertz模型擬合效果最佳［24］。本研究也利用修改后的Gompertz模型建立了鮮切水芹假單胞菌屬的生長曲線模型，能夠有效地擬合出4 ℃和22 ℃兩個溫度條件下假單胞菌屬的動態變化。

低溫貯藏可以顯著降低鮮切蔬菜的呼吸速率，減少酶促代謝，并抑制微生物的生長繁殖，從而延長貨架期。研究［25］表明，鮮切獼猴桃在2 ℃條件下貯藏7 d 的細菌總數比在20 ℃條件下貯藏 4.5 d 少 2 個數量級。本研究結果顯示，4 ℃條件下鮮切水芹貯藏20 d后假單胞菌屬數量達到106CFU/g，而在22 ℃條件下貯藏時，假單胞菌屬數量短時間內急劇增長，貯藏7 d即超過106CFU/g，同時，4 ℃條件下假單胞菌生長速率顯著低于22 ℃。

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Microbial Growth Model and Shelf-Life Prediction of Fresh-Cut Cress during Storage

TIAN Mengqi， YANG Runqiang， ZHUANG Yan ， GU Zhenxin*（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Pseudomonas was found to be the dominant bacteria of fresh-cut cress during storage when microfl ora analysis of cress was performed using selective medium. Fresh-cut cress was packaged in sealed bags and then stored for 8 d at 22 ℃and the number of Pseudomonas reached 106CFU/g. The results showed that low temperature storage inhibited the growth and reproduction of Pseudomonas. A modifi ed Gompertz model could fi t effectively the dynamic changes of Pseudomonas count at 4 and 22 ℃. The deviation factor and accurate factor showed that the model was effective. The dynamic changes of chlorophyll and lignin in fresh-cut cress during storage for 3 day at low temperature followed by at room temperature （22 ± 1） ℃ could be fi tted to a fi rst-order kinetic model. The shelf-life of fresh-cut cress can be predicted according to the growth rate of spoilage bacteria in actual application.

fresh-cut cress； storage； microorganism； shelf-life

TS255.3

A

1002-6630（2015）18-0231-06

10.7506/spkx1002-6630-201518043

2015-04-14

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B03）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）

田夢琦（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品中功能成分的富集技術。E-mail：2014808092@njau.edu.cn

顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向為生物技術與功能食品。E-mail：guzx@njau.edu.cn