產質粒介導AmpC酶革蘭陰性菌的耐藥性分析及基因分型

莫煥桐 張健 陳新瑤 陳偉忠 朱偉東 陳淑貞

產質粒介導AmpC酶革蘭陰性菌的耐藥性分析及基因分型

莫煥桐 張健 陳新瑤 陳偉忠 朱偉東 陳淑貞

目的 分析潮州地區產質粒介導AmpC酶革蘭陰性菌的耐藥情況及基因分型，指導臨床合理應用抗生素。方法 收集133株無重復多重耐藥革蘭陰性桿菌，行頭孢西丁敏感試驗、三維確證試驗檢測產質粒介導AmpC酶并分析其對12種常用抗菌藥物的耐藥性。同時對產質粒介導AmpC酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌進行AmpC酶基因分型。結果 133株菌中33株產質粒介導AmpC酶，發生率24.8%。15株產質粒介導AmpC酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中9株檢測出3種基因型：MOX型株2株、DHA型株4株、MIR型株3株。產質粒介導AmpC酶菌株大多數耐藥率＞80%，且呈多重耐藥。結論 潮州地區革蘭陰性桿菌產質粒介導AmpC酶發生率較高，菌種分布范圍較寬，耐藥性強，為提高革蘭陰性桿菌的治療效率，應當加強產質粒介導AmpC酶的監測。

革蘭陰性桿菌 產質粒介導AmpC酶 耐藥性 基因分型

革蘭陰性桿菌是臨床常見致病菌或條件致病菌，目前已成為醫院感染的重要病原菌，尤其是產超廣譜β-內酰胺酶和產質粒介導AmpC 酶的革蘭陰性桿菌耐藥性嚴重，其耐藥性的變遷和多重耐藥的出現，給臨床治療帶來巨大困難。作者收集133株無重復多重耐藥革蘭陰性桿菌進行頭孢西丁敏感試驗、三維確證試驗、同時運用PCR技術檢測其基因型。報道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 2011年1月至2013年12月分離自潮州市人民醫院住院患者無重復多重耐藥革蘭陰性桿菌133株，其中痰液95份、尿液25份、咽拭子4份、膿液4份、腹水5份。同時做室內質控，質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，由廣東省臨檢中心提供；陰溝腸桿菌029M、大腸埃希菌DH5a2919、肺炎克雷伯菌ATCC700603，由汕頭大學第一附屬醫院惠贈。采用法國生物梅里埃公司VITEK2 AST GN13藥敏板進行抗菌藥物敏感性試驗。頭孢西丁紙片均購自英國OXODI公司。利用AmpC酶對頭孢西丁（FOX）耐藥的性質，篩選耐藥菌株。

1.2方法 （1）酶粗提液制備：挑取單個菌于6ml的LB肉湯中，35℃搖振培養過夜，于4℃、4000r/ min離心25min，棄上清液留沉渣-20℃凍融，反復凍融8次，加0.1mol磷酸鹽緩沖液0.75ml，混懸沉渣，4℃，14000r/min離心lh，取上清液-20℃冷凍保存備用。（2）頭孢西丁三維試驗：將0.5 麥氏單位大腸埃希菌ATCC25922 菌液均勻涂布于MH 瓊脂平皿，取一30μg FOX紙片置于平皿中心，用消毒200μl槍頭粗端在距離FOX紙片5 mm 處對稱打孔，用微量加樣器在一孔加入酶粗提物60μl，另孔加入酶粗提物50μl+20mmol/L CLO10μl，避免加入液體溢出孔。35℃溫箱培養過夜。如酶粗提物中含有 AmpC 酶，則在加入酶粗提物的孔與抑菌圈交接處由于 AmpC 酶水解 FOX，故出現擴大的長菌區，而由于AmpC 酶活性可被CLO抑制，所以在酶粗提物+CLO混合液的孔與抑菌圈交接處不出現擴大的長菌區，為 FOX三維試驗陽性。如酶粗提物中無AmpC 酶，則兩個孔與抑菌圈交接處均未出現擴大的細菌生長區，為FOX三維試驗陰性。以E.cloacae 029M為陽性對照，E.cloacae 029 為野生型作為陰性對照。（3）PCR基因擴增：PCR檢測質粒AmpC酶基因、引物的設計、PCR反應體系和反應條件參照參考文獻［1］，質粒介導AmpC酶基因PCR引物序列（見表1）。PCR擴增AmpC酶基因，PCR試劑盒均購自無錫市克隆遺傳技術研究所。總反應體積20μl（其中模板2μl）。熱循環參數：93℃預變性2min，然后按93℃30s，55℃30s，72℃60s，共循環35次，最后72℃延伸2min。（4）PCR產物分析與測序：PCR產物在含0.5μg/ml溴乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性，用凝膠成像系統攝像保存后切膠回收純化。

表1　質粒介導AmpC酶基因PCR引物序列

2　結果

2.1133株耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌AmpC酶三維法試驗結果 見表2。133株耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌產質粒介導AmpC酶三維法試驗陽性株數為33株，發生率為24.8%。

表2　133株耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌AmpC酶三維試驗結果

2.2AmpC基因檢測結果 15株產質粒介導AmpC酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌有9株擴增出3種AmpC酶基因。見表3。

表3　15株產質粒AmpC酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌基因檢測結果

2.333株產質粒AmpC酶菌對常用抗菌藥物耐藥率 見表4。

表4　33株產質粒AmpC酶菌對抗菌藥物耐藥率（%）

3　討論

20世紀后期，抗生素的發現和應用明顯降低了與感染相關的病死率。青霉素和頭孢菌素等β-內酰胺類抗菌藥物在長期使用中，細菌逐漸對其產生耐藥性，使其抗菌作用減弱或消失，常出現使用效果不理想的現象［2］。目前，越來越多的研究表明［3］，革蘭陰性桿菌對三代頭孢菌素的耐藥主要由高產AmpC酶介導。AmpC酶是由腸桿菌科和/或銅綠假單胞菌的染色體或質粒介導產生的一類β-內酰胺酶，是作用于頭孢菌素且不被克拉維酸所抑制的β-內酰胺酶，故AmpC酶又稱作頭孢菌素酶。在多種革蘭陰性桿菌的染色體上均存在編碼AmpC酶的結構基因，在一定條件下，這類細菌可被誘導或基因突變而表達AmpC酶［4，5］。

本資料中133株耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌產質粒AmpC酶株數為33株，發生率為24.8%。其中肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的發生率分別為24.4%、13.9%、22.7%、26.7%。產質粒AmpC酶菌還涉及其它9個菌種。表明耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌產質粒AmpC酶檢出率較高，并且菌種分布寬，因此應加強對耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌產質粒AmpC酶菌株的鑒測。15株產質粒介導AmpC酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌有9株擴增出3種AmpC酶基因，其中大腸埃希菌6株、肺炎克雷伯菌3株，基因型分布為：MOX型株（大腸埃希菌1株、肺炎克雷伯菌1株）、DHA型株（大腸埃希菌2株、肺炎克雷伯菌2株）、MIR型株（大腸埃希菌3株）。其它株可能帶有AmpC酶的其它基因型，后續將進一步進行其它基因型的檢測。本資料表明本地區革蘭陰性桿菌質粒介導AmpC酶有MOX型、DHA型、MIR型的存在。產AmpCβ-內酰胺酶是革蘭陰性菌對廣譜、超廣譜β-內酰胺抗生素耐藥的重要機制，其比ESBLs更寬的底物譜且對酶抑制劑不敏感造成臨床治療困難，質粒AmpC酶的出現和不斷增加的種類以及在菌種之間的傳遞更加劇了這一耐藥問題，本資料顯示，產質粒介導AmpC酶菌株除對亞胺培南、頭孢吡肟耐藥性較低外，對其它抗菌藥物均高度耐藥，部分菌株耐藥率＞80%，且呈多重耐藥。因此研究簡便、快速、準確的AmpC酶檢測方法應用于臨床實驗室，對耐藥菌進行檢測、監控、指導合理正確使用抗生素，是控制、減緩耐藥蔓延發展的迫切需要，另外更需要研制開發新一代抗生素和酶抑制劑來對抗細菌的耐藥進化問題，這是解決臨床細菌耐藥的根本途徑。

1 王冬國，周鐵麗.質粒介導產AmpC酶大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌AmpC基因型檢測與分析.中華醫院感染學雜志，2007，17（7）：782～785.

2 江潔華，廖偉嬌，徐軍等.多重耐藥革蘭陰性桿菌產β-內酰胺酶的表型及基因型研究.中華醫院感染學雜志，2007，17（5）：492～495.

3 余嫻，袁斌，雷軍.產“超-超廣譜”β-內酰胺酶革蘭陰性桿菌的耐藥表型及基因分析.中國抗生素雜志，2011，36（1）：56～59.

4 Verdet C，Arlet G，Barnaud G，et al.A novel integron in Salmonella enterica serovar Enteritidis，carrying the bla（DHA-1）gene and its regulator gene ampR，originated from Morganella morganii.Antimicrob Agents Chemother， 2000 Jan，44（1）：222～225.

5 Barnaud G，Arlet G，Verdet C，et al.Salminella enteritidis：AmpC plasmid-mediated inducible beta-lactamase（DHA-1）with anampR gene from Morganella morganii.Antimicrob Agent Chemother， 1998 Sep，42（9）：2352～2358.

廣東省潮州市科技計劃項目（2013510）

521011廣東省潮州市人民醫院（莫煥桐 張健 陳新瑤 陳偉忠 朱偉東）515041 汕頭大學醫學院第一附屬醫院（陳淑貞）