綠僵菌HC毒素合成酶基因的生物信息學分析

張杰等

摘要：通過生物信息學的方法對綠僵菌HC毒素合成酶基因進行了分析。生物信息學分析表明，它在一級結構、二級結構、三級結構上接近于植物病原真菌，但是其一級結構上并不保守。

關鍵詞：NCBI；蛋白；核酸；生物信息學

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0071-03

收稿日期：2014-08-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：31171897）；河南省教育廳自然科學研究計劃（編號：2010B180031）；周口師范學院科研成果孵化專項（編號：2011-zknufh）。

作者簡介：張杰（1975—），男，河南太康人，博士研究生，講師，研究方向為分子生物學與生物工程。E-mail：zhangjiezk@qq.com。

通信作者：胡炳義，教授，研究方向為生物技術。E-mail：bingyihu@126.com綠僵菌是農業害蟲防治的主要病原真菌之一，其致病性主要依賴毒素麻痹宿主的防御。綠僵菌HC毒素是三輪狀結構的環狀四肽（D-Pro-L-Ala-D-Ala-L-Aeo），Aeo表示2氨基9，10氟環唑8 3-羰基癸酸乙酯[1]。在玉米黑粉病中，HC毒素是黑粉病菌侵染玉米過程中的特異性和毒力的決定性因素[2]。HC毒素是微生物為數不多的第二代謝產物之一。在植物、昆蟲和哺乳動物中HC毒素是組蛋白脫乙酰基酶（HDACs）的抑制因子[3]，然而，昆蟲病原真菌侵染宿主時抑制宿主HDACs 致病和生物合成的機制尚不清楚[4-6]。利用生物信息學技術分析HC毒素合成酶的進化 、二級結構、三級結構、跨膜結構域及物理化學性質，可以為生物學功能的進一步研究提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

以NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中的綠僵菌數據庫為材料。

1.2方法

1.2.1序列的查找通過NCBI數據庫搜索HC毒素合成酶的蛋白序列，再通過綠僵菌數據庫NCBI/BLAST/tblastn搜索綠僵菌的核酸序列，進而獲得HC毒素合成酶基因的全長序列。

1.2.2序列的生物信息學分析用DNAman軟件對HC毒素合成酶蛋白序列運行clustalW、親水性、疏水性和跨膜結構分析；應用MEGA 5.0構建系統發育樹；用The PSIPRED Protein Sequence Analysis Workbench和COILS在線分析二級結構，SMART在線分析二級結構及結構域；用swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）數據庫在線建模和三級結構分析[7-10]；用SignalP 4.1 Server預測蛋白序列的信號剪切位點；蛋白質結構域的預測用在線SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）；利用KEGG數據庫分析其所在的信號通路；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）數據庫在線預測其物理和化學性質。

2結果與分析

2.1HC毒素合成酶一級結構和信號肽預測

基于一級結構上的同源性對蛋白序列運行clustalW和系統發育樹的構建。由圖1-A可知綠僵菌HC毒素合成酶總共有290個氨基酸，在一級結構上保守型極低，在不同的病原菌中只有一個共同的甘氨酸位點 （黑色、藍色和紅色區域分別表示相同性高于90%、75%和50%）。由圖1-B可知綠僵菌的HC毒素合成酶與半知菌類的蟲生真菌白僵菌具有較高同源性（88%），其次是動物病原菌（53%）。用SignalP 4.1 Server對其一級結構上的信號肽進行預測。由圖1-C表明該蛋白序列在第19個氨基酸位置具有信號肽位點，其預測分值為0.8，信號肽序列為MLLSSAAVVLGALQPALG，與swissmodel和SMART在線預測結果相一致，可能是分泌性蛋白。

2.2HC毒素合成酶二、三級結構預測

在一級結構的基礎上用COILS在線分析了HC毒素合成酶的二級結構。從圖2可以看出，HC毒素合成酶有3個α-螺旋結構，在蛋白中的含量為3.45%；13個β-折疊，其含量為16.55%；無規則卷曲最多，其含量為80%。而在線SMART預測到其內部有2個重復序列及前端的信號肽序列，沒有預測到特征性結構域。

2.3HC毒素合成酶親水性、疏水性、跨膜結構和分子結構的預測

從圖3-A可知，HC毒素合成酶最高親水性分值為194，而最低分值為-1.91，總體親水性為-0.471；從圖3-B可知，HC毒素合成酶疏水性不顯著，其疏水性最高分值為303，最低值為-3.28，推測其可能是水溶性蛋白；從圖3-C可知，HC毒素合成酶沒有跨膜結構。圖3-D是預測到的HC毒素合成酶的分子結構，分子式為C1357H2136N390O417S24，分子量為31 355.6。

2.4HC毒素合成酶三維建模

從圖4-A和4-B可知，在SWISS-MODEL數據庫中搜

索到了HC毒素合成酶的模板，它與靶蛋白的相似性評估得分為37.93%（圖4-C），正常的QMEAN4分值為-3.52，靶蛋白與模型氨基酸的對應序列如圖4-E所示。建模結果表明該蛋白的三維結構與上述預測結果相一致。

2.5HC毒素合成酶抗原性片段、物理和化學性質分析

用DNAman軟件預測到該氨基酸含有17個抗原肽段，其分值和長度（紅色字母表示最大分值位點）分別如下：

[1]分值=1.181，長度=21，4-SSAAVVLGALQPALGKPSLLR-24；[2]分值=1.179，長度=16，272-RPALCLIAGEPTCAPV-287；[3]分值=1.172，長度=12，204-DGLFCRHPCGGA-215；[4]分值=1.162，長度=22，246-ERCYKADDCDHGLFCEHQCGGA-267；[5]分值=1.162，長度=13，150-GDGLFCEHQCGGP-162；[6]分值=1.150，長度=7，108-AAFVCED-114；[7]分值=1.147，長度=26，40-AATEIVIDYLAPNPPCGPYSPWVGIW-65；[8]分值=1125，長度=13，119-AWIVSQPFKVDKE-131；[9]分值=1.123，長度=8，195-RCSQVNEC-202；[10]分值=1.123，長度=7，220-SNVCLIG-226；[11]分值=1.110，長度=10，228-EPTCAPVRQE-237；[12]分值=1.106，長度=7，32-NEVVNQR-38；[13]分值=1.090，長度=7，141-ERCYEAD-147；[14]分值=1.089，長度=15，168-SAMCFIAGEPKCRPI-182；[15]分值=1.080，長度=7，79-AWAYVKP-85；[16]分值=1.074，長度=7，67-ADACNSF-73；[17]分值=1.072，長度=14，93-NVKLNLSDLDVGEY-106。

其物理化學性質用ProtParam在線預測，結果表明該蛋白的等電點為5.70，總共有4 324個原子組成，假定所有的半胱氨酸形成二硫鍵，它們在水中280 nm的消光系數為 33 680 L/（mol·cm）；假定所有的半胱氨酸是還原態，它們在水中 280 nm 的消光系數為32 430 L/（mol·cm）。其氮端起始氨基酸為Met，預測到該蛋白在哺乳動物網狀細胞中，離體狀態下的半衰期為30 h；在酵母活體中的半衰期為大于20 h；在細菌活體中的半衰期大于10 h。其不穩定性指數為4172，屬于不穩定性蛋白。其脂肪族指數為66.69。

3討論

利用生物信息學的方法對研究的基因進行正確預測是現代分子生物學研究的有效手段之一[11-12]。隨著生物信息學算法和蛋白質結構預測研究的深入，生物信息學在生物科學領域的研究非常重要[13]。HC毒素合成酶的同源序列比對及系統進化樹的分析結果與Gao等的研究結論[14]一致，說明生物信息學預測是正確的。同軟件與在線對信號肽段預測結果相一致，與Nadine等的報道結果[15]一致。HC毒素合成酶的二級結構和三級結構的預測與Jones 等報道的玉米圓斑病菌相似[16]。HC毒素合成酶的物理化學性質及抗原片段尚未有報道。總體來說，綠僵菌HC毒素合成酶結構及功能接近禾本科病原菌，它與植物病原菌的異同尚需試驗證明，其物理化學性質也需進一步的驗證。表明生物信息學是現代生物學中重要的技術手段，與其他生物學技術相結合是生物學研究的必要途徑。

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