杜仲胚乳誘導產生三倍體愈傷組織的研究

孫永健等

摘要：探討了水、赤霉素GA3對杜仲完整種子與剝離胚乳產生的愈傷組織的作用，設置了不同激素種類及濃度配比的培養基并在培養基中添加了酵母提取物與水解酪蛋白，研究了激素、外源有機添加物對胚乳愈傷組織的誘導與改造的作用。結果表明，最佳的前處理方式為：800 mg/L的赤霉素浸泡完整種子24 h；最佳的愈傷組織誘導培養基為：MS+瓊脂6.3 g/L+蔗糖30 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；對愈傷組織繼代與改造有較好促進作用的外源有機添加物為：酵母提取物。

關鍵詞：杜仲；胚乳培養；三倍體愈傷組織；赤霉素

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0090-03

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）別稱思仙，主產于河南、四川、江蘇等地，為杜仲科杜仲屬植物，且杜仲科僅1屬1種，為我國特有的一種名貴藥用植物，資源稀少，具有補腎壯腰、抑制腫瘤生長、雙向調節血壓等作用[1-3]；它也是溫帶最具開發利用前景的膠源植物，在它的葉片、樹皮、根皮和果皮中都含有杜仲膠，經濟價值很高[4-6]。杜仲為二倍體（2n=2x=34）落葉喬木，以種子繁殖為主，以收獲樹皮、樹葉等營養體為主要栽培目的。杜仲種子中的胚乳是雙受精的產物，因此是三倍體，鑒于多倍體植物具有器官巨大、抗逆性強和生化物質含量高等特點，結合杜仲的藥用和經濟價值，多倍體育種應成為杜仲遺傳改良的主要途徑之一[7-9]。因此，通過組織培養的方法，誘導杜仲胚乳產生三倍體愈傷組織，可以為后續再分化獲得三倍體植株提供物質基礎，而且利用三倍體植株細胞體積增大的特點可以提高杜仲單株產膠量或細胞次生代謝產物含量[10-14]。

1材料與方法

1.1供試材料

杜仲成熟種子采自天津農學院。

1.2試驗方法

1.2.1材料的前處理將新采收的成熟飽滿的杜仲翅果晾干，剝去果皮，取出種子，洗凈。做以下5種處理：A：將種子沿背腹線切成兩半，剔除其中種胚，留胚乳備用；B：按上述方法取得胚乳，用無菌水浸泡24 h；C：按上述方法取得胚乳，置于GA3中浸泡24 h（設置GA3的濃度分別為C1處理：400 mg/L、C2處理：600 mg/L、C3處理：800 mg/L、C4處理：1 000 mg/L）；D： 將完整的種子置于無菌水中浸泡24 h；E：將完整的種子置于GA3中浸泡24 h（設置GA3的濃度分別為E1處理：400 mg/L、E2處理：600 mg/L、E3處理：800 mg/L、E4處理：1 000 mg/L）。將處理好的材料，用70%乙醇浸泡15 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%Hgcl2處理6 min，無菌水沖洗5次后備用。

1.2.2愈傷組織的誘導將滅菌后的胚乳置于無菌的培養皿中，在超凈臺中切除每扇胚乳子葉端的3/4，將占種子全長1/4的胚根端胚乳接種到愈傷組織誘導培養基中；滅好菌的完整種子，先在無菌的環境下剝離種胚，取得胚乳，再按上述方法切割后接種。愈傷組織誘導培養基見表1。

1.2.3愈傷組織的繼代與改造將誘導產生的愈傷組織切下，接種到繼代培養基中，繼代培養基配方見表2。

表2愈傷組織繼代培養基

處理酵母提取物

（mg/L）水解酪蛋白

（mg/L）G100G28000G30800注：培養基為MS+ZT 0.8 mg/L + NAA 0.8 mg/L +瓊脂6.3 g/L+蔗糖30 g/L。

2結果與分析

2.1取材部位與前處理方法對愈傷組織誘導的影響

經不同方式處理后的材料接種于誘導培養基2周后，大部分胚乳開始膨大（圖1）。為避免褐化現象加重，將膨大的部分切下，繼續接種于相同成分的培養基中，再經35 d左右的培養，部分膨大的胚乳會形成疏松白色的愈傷組織（圖2）。統計愈傷組織形成的數量發現，水和GA3的浸泡對于胚乳脫分化形成愈傷組織具有促進作用，且GA3的促進作用優于水，愈傷組織誘導率最高可達20.2%；GA3的促進作用會隨著濃度的增大而增大，濃度為800 mg/L時，愈傷組織的誘導效果最好，當濃度達到1 000 mg/L時GA3的促進作用又開始下降（表3、圖3）；完整種子中的胚乳相對于剝離出來的胚乳，脫分化形成愈傷組織的能力更強（表3）。

2.2培養基對愈傷組織誘導的影響

研究發現，在不添加激素的培養基中，胚乳雖然可以膨

大，但是不能形成愈傷組織。因此，向培養基中添加了3種不同濃度配比的激素。統計愈傷組織形成的數量發現，NAA在一定濃度范圍內，具有促進杜仲胚乳形成愈傷組織的作用；雖然2，4-D在很多植物中具有促進愈傷組織形成的作用，但是在杜仲胚乳形成愈傷組織的過程中，2，4-D起了抑制作用，且這種抑制作用會隨著培養基中其他激素濃度的增大而增大；誘導杜仲胚乳產生愈傷組織的最佳激素種類及濃度配比為：6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，誘導率最高可達114%（表4）。

2.3外源添加物對愈傷組織生長的作用

經誘導后初生的疏松白色的愈傷組織生長慢且不具備分化能力，需將其轉移到繼代培養基中進行繼代培養。在繼代1～2次之后，部分會轉變成綠色且質地緊密、具有分化能力的愈傷組織（圖4、圖5），未轉變的愈傷組織繼續在相同的培養基中進行繼代，會逐步轉變。研究發現，激素種類及濃度配比為ZT 0.8 mg/L + NAA 0.8 mg/L時，對愈傷組織的繼代與改造效果最佳；適當添加外源有機物對愈傷組織的改造具有促進作用，其中酵母提取物（YE）的促進效果最佳，愈傷組織改造率可達41.5%，新生的愈傷組織顏色綠且質地緊密，經2周繼代培養后，增殖效果也較好（表5、圖4）。

3討論

Srivastava[8]在羅氏核實木胚乳培養研究中指出，利用成熟胚乳培養誘導愈傷組織時，必須有原位胚的參與或用GA3進行處理。本研究支持了Srivastava這一觀點，水的浸泡對完整種子中的胚乳誘導愈傷組織有促進作用而對剝離的胚乳沒有作用，說明了完整種子經水浸泡后休眠被打破，種子中的胚被活化，從而影響胚乳的誘導。而GA3具有打破種子休眠、促進發芽的作用，因此會對胚乳產生類似種胚在萌發過程中對其產生的影響， 從而促進了胚乳愈傷組織的誘導。但GA3表5不同外源添加物對愈傷組織生長的作用

處理接種愈傷組織數

（個）愈傷組織變化數

（個）改造率

（%）愈傷組織質地愈傷組織顏色繼代2周后愈傷

組織大小G11382618.8稍疏松淺綠色較大G21476141.5緊密綠色較大G31334332.3較緊密淺綠色大

為植物生長調節劑，須在一定濃度范圍內使用，濃度過高，反而會對胚乳誘導愈傷組織產生抑制作用。

2，4-D作為植物生長調節劑，可以促進植物組織的膨大，但它對胚乳愈傷組織誘導的抑制作用可能是由于其可以干擾植物體內激素的平衡，破壞核酸和蛋白質的代謝，從而抑制胚乳向生長旺盛的愈傷組織進行脫分化。在培養基中添加酵母提取物、水解酪蛋白等外源有機物，可以在繼代培養時有效促進愈傷組織的改造與增殖，這是由于它們富含多肽、氨基酸、核苷酸、維生素、微量元素等營養成分，且比例協調，尤其是其所含的一些生長因子成分，可以對愈傷組織的生長、改造、再分化等具有較好的促進作用[19]。

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