優質肉雞硫胺素含量以及TPK1基因的多態性分析

王海等

摘要：為研究大恒優質肉雞硫胺素沉積規律及大恒肉雞不同家系間硫胺素的差異，選取大恒優質肉雞的4個品系（S08、S07×S01、D2、D1）為試驗材料，采用高效液相色譜法對硫胺素含量進行測定，并對其相關基因TPK1進行多態性分析。結果顯示：10周齡時，S08品系胸肌中硫胺素含量極顯著高于品系D1、D2（P<0.01），4個品系中公雞胸肌中的硫胺素含量均高于母雞，差異不明顯；10周齡時，公雞、母雞中腿肌的硫胺素含量極顯著高于胸肌（P<0.01），公雞中的腿肌、胸肌硫胺素含量均分別高于母雞的腿肌、胸肌，但都差異不明顯。對大恒肉雞5個品系（S07×S05、S07、S08、S07×01、S08×01）TPK1基因的所有外顯子及部分3′非編碼區進行了多態性位點的檢測，在3′非編碼區發現了1個G878A單堿基突變，該SNP位點對腹脂質量具有顯著影響（P<0.05），該基因座上的基因型NN個體的腹脂質量顯著高于基因型MN個體的腹脂質量，但與大恒優質肉雞2個品系雞肉中硫胺素含量差異不顯著。

關鍵詞：優質肉雞；硫胺素；TPK1基因；基因多態性

中圖分類號：S831.1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0237-03

硫胺素（Thiamine）即維生素B1，不僅是維持機體代謝的重要物質，而且是肉產品產生芳香物質的關鍵前體物質。熱降解硫胺素可以產生許多含硫化合物，包括硫醇、硫化物、二硫化合物等芳香化合物[1-2]，其中2-甲基-3-巰基呋喃、2/3-巰基-3/2-戊酮是重要的揮發性化合物，5-羥基-3-巰基-2-戊酮不僅是硫胺素降解過程中的重要中間產物，而且是一類芳香化合物。因此，硫胺素及其衍生物的含量已經成為了肉食品品質的重要指標。本研究以4個優質肉雞品系為樣本，研究硫胺素的含量差異，同時對硫胺素合成代謝關鍵酶中硫胺焦磷酸激酶（TPK1）基因進行多態性分析[3]，以期為優質肉雞的選育提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗動物

試驗材料為四川大恒家禽有限公司培育的S08、S07×S01、D2、D1、S07×05、S07、S08×S01 共7個品系總，試驗雞有專人飼養，飼養條件及營養水平一致，統一在70日齡屠宰，屠宰前翅下靜脈采血保存于真空采血管中，4 ℃保存用于DNA的提取。

1.2試驗方法

1.2.1肌肉中硫胺素含量的測定采用高效液相色譜法（熒光檢測）。準確稱取4～6 g肉樣，使用電動勻漿器勻質后置于250mL三角瓶中，加入50 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液混勻，于高壓滅菌鍋中121 ℃處理30 min，室溫冷卻。用2 mol/L乙酸鈉溶液調節水解液使pH值為4.0～4.5，加入高峰氏淀粉酶，置于水浴鍋中45～50 ℃酶解3 h，冷卻后全部移至100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，混勻后用濾紙過濾，將濾液放置于4 ℃冰箱中保存。吸取5 mL試樣加入到50 mL EP管中，再加入1.5 g氯化鈉、3 mL氧化劑混勻，然后加入10 mL異丁醇萃取，靜置分層后取上清液過0.45 μm濾膜，即可上樣檢測。

高效液相色譜儀為安捷倫高效液相色譜儀（配有1200熒光檢測器）。流動相：乙酸鈉（0.05 mol/L，pH值4.5） ∶甲醇（35% ∶65%）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：激發波長365 nm；發射波長：435 nm；進樣量：15 μL。

1.2.2雞基因組的提取采用Axygen公司AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒來提取雞血樣中的基因組DNA。獲得的DNA樣品分為2份，1份用于試驗，放置于4 ℃條件；另一份放在-70 ℃中長期保存，用以單鏈構象多態性（SSCP）分析。

1.3數據處理

10周齡大恒優質肉雞肌肉中不同品系間硫胺素含量的差異顯著性比較采用SPSS 17.0 軟件包中廣義線性模型（general linear model，GLM）進行最小顯著差異（least significant difference，LSD ）分析，采用 Correlate 程序進行體質量與硫胺素含量的相關性分析。

2結果與分析

2.1硫胺素含量的變化

2.1.110周齡肉雞不同品系肌肉中硫胺素含量10周齡大恒優質肉雞S08、S07×S01、D2、D1等4個品系的硫胺素含量如表1所示。可以看出，在母雞中S08品系胸肌中的硫胺素含量最高，D1品系胸肌中的硫胺素含量最低；S08、S07×S01品系間差異不顯著，但與D2、D1差異極顯著（P<001），D2、D1品系間差異不顯著。在公雞中S08、S07×S01品系間差異不顯著，但分別與D2、D1差異極顯著（P<0.01），D2、D1品系間差異不顯著。在4個品系中所有公雞胸肌中的硫胺素與

2.1.210周齡不同組織及性別的硫胺素含量在10周齡時，公雞中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，并且達到極顯著水平（P<0.01）；母雞中腿肌的硫胺素含量高于胸肌，也達到了極顯著水平；公雞中的胸肌、腿肌的硫胺素含量分別高于母雞（表2）。

表2不同組織及性別硫胺素的含量

組織公雞母雞硫胺素含量

（mg/kg）數量

（羽）硫胺素含量

（mg/kg）數量

（羽）胸肌1.021±0.453B270.701±0.217B17腿肌1.483±0.267A291.231±0.346A15注：同列數據后標有不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

2.2TPK1基因多態性分析

2.2.1樣品DNA的提取及引物的設計合成引物采用Primer Premier 5.0軟件設計（表3），設計的結果經NCBI數據庫的Primer-BLAST對引物進行在線比對驗證，鑒定合格后由上海Invitrogen公司合成，所有引物均為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純度。表3TPK1基因所有外顯子及部分非編碼區的擴增引物

本研究總共設計了9對引物，對TPK1基因所有外顯子及部分非編碼區進行了掃描，以大恒肉雞5個品系（S07×SO5、S07、S08、S07×01、S08×01）為研究材料。結果顯示，所有9對引物的PCR擴增效果都很好，目的片段與所設計的片段大小一致，無非特異性擴增產生，都可以用于SSCP研究。PCR-SSCP研究結果顯示，TPK13′UTR引物在大恒肉雞5個品系內存在多態性，3′UTR引物所擴增的片段存在3種基因型，分別定義為MN、MM、NN（圖1）。

2.2.2序列分析結果取MN、NN、MM 3種基因型的PCR產物進行純化測序，結果顯示MM基因型與數據庫Ensembl

（登錄號：ENSGALT00000020200）中的序列一致，將其定義為野生型。MM型與NN型相比存在1個G878A單堿基突變，將其定義為突變型。測序結果如圖2所示。

2.2.35個品系TPK1不同基因型差異檢驗根據PCR-SSCP的檢測結果，對TPK1各種基因型在5個品系中的分布進行χ2檢驗，以檢驗各個群體是否處于Hardy-Weinberg 平衡。由表4可知，大恒肉雞5個品系都符合Hardy-Weinberg 平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有5個品系都以等位基因M為主。對5個品系的基因雜合度及多態信息含量分析顯示，5個品系多態性均屬于高度多態。

3結論與討論

3.1硫胺素含量分析

對大恒優質肉雞S08、S07×S01、D2、D1 4個品系的硫胺

素的含量進行檢測及比較結果顯示，在10周齡時S08品系公雞、母雞胸肌中的硫胺素含量都是最高的，D1品系中硫胺素的含量較低，4個品系中公雞胸肌中的硫胺素含量都高于母雞，這與陳國宏等研究的結果一致[4-6]。在相同的飼養條件及營養水平下，大恒優質肉雞腿肌中的硫胺素含量都比胸肌高，這與陳國宏等的研究結果[4]基本一致。在大恒優質肉雞中各個品系的胸肌、腿肌的平均硫胺素含量分別為0.816、1.357 mg/kg，比陳國宏等所研究的地方雞在12周齡時的平均硫胺素含量0.44mg/kg還要高[4]，這可能是檢測方法不一樣或飼養條件、營養水平不同導致的，但也表明了大恒優質肉雞肌肉中的硫胺素含量還是相對較高的。

3.2TPK1基因多態性分析

本研究對大恒雞5個品系TPK1基因的所有外顯子及部分3′非編碼區進行了多態性位點的檢測，在3′非編碼區發現了1個G878A單堿基突變，對TPK1各種基因型在5個品系中的分布進行χ2檢驗及SNP位點基因型、基因頻率研究。結果顯示，大恒雞5個品系都符合Hardy-Weinberg 平衡，表明這5個品系在該位點受到的選擇作用比較微弱，或是在經過選擇后又重新達到了平衡。S07×S05品系以MM基因型偏多，S07×S01品系以MN基因型偏多，所有的5個品系都以等位基因M為主。在所有的5個品系中NN基因型只占總基因型的16%，這可能是由于群體數量相對來說還比較少。

綜上所述可見大恒優質肉雞不同品系肌肉中硫胺素在肌肉中的沉積規律及大恒雞不同家系間硫胺素的差異，TPK1 3′UTR發現了1個G878A單堿基突變，但與大恒優質肉雞雞肉中硫胺素含量差異不顯著。這些結果對于今后從育種角度開發利用地方優質雞種資源有重要意義。

參考文獻：

[1]Resconi V C，Escudero A，Campo M M. The development of aromas in ruminant meat[J]. Molecules，2013，18（6）：6748-6781.

[2]Cerny C，Guntz-Dubini R. Identification of 5-hydroxy-3-mercapto-2-pentanone in the maillard reaction of thiamine，cysteine，and xylose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（22）：10679-10682.

[3]孟春玲. 雞肌肉硫胺素相關候選基因遺傳多樣性及其與硫胺素含量相關性研究[D]. 揚州：揚州大學，2008.

[4]陳國宏，羅方妮，吳信生，等. 地方雞種肌肉硫胺素的含量比較研究[J]. 肉類工業，2001（增刊1）：50-52.

[5]王克華，竇套存，曲亮，等. 硫胺素在雞肌肉中的沉積規律研究[J]. 中國畜牧獸醫，2009，36（11）：198-200.

[6]謝愷舟，戴國俊，王金玉，等. 京海黃雞肉用性能及肉品質的研究[J]. 揚州大學學報：農業與生命科學版，2008，29（1）：45-48.郝福星，左偉勇，劉莉. Clin ProTool結合質譜分析弓形蟲急性感染小鼠血清多肽[J]. 江蘇農業科學，2015，43（9）：240-241.