結晶紫高效脫色菌株的篩選、鑒定與脫色特性

摘要：結晶紫是一類難以降解且對許多生物都具有致癌致畸性的三苯甲烷類染料，篩選能夠高效脫色結晶紫的菌株對修復受污染水體具有重要意義。從浙江溫州分離篩選到1株結晶紫高效降解菌株CV-b，系統地研究了各操作因素對該菌株脫色結晶紫的影響。經16S rRNA基因序列分析表明，該菌株屬于腸桿菌屬（Enterabacter sp.）。當pH值在3.0～10.0之間時，培養24 h以后，該菌株對50 mg/L結晶紫的脫色率均在50%以上；脫色的最適溫度范圍為 25～35 ℃；多數供試碳源對脫色有顯著促進效應，而多數供試氮源則對脫色無顯著影響；供試金屬離子中，Cu2+、Fe3+和Zn2+對脫色有顯著的促進效應。動力學試驗結果表明，該菌株對結晶紫的脫色與對數模型擬合度較高（r2=0.942 7）。經脫色前后的全波長掃描分析顯示，菌株CV-b對結晶紫的脫色是由生物降解引起的。總體而言，菌株CV-b在結晶紫脫色中的實際應用潛能較大。

關鍵詞：腸桿菌屬（Enterabacter sp.）；結晶紫；脫色特性；動力學

中圖分類號： X703；Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0378-03

工業廢水中的污染物種類繁多，其中合成染料對環境的影響極為惡劣，廢水中的染料泄漏至環境水體中，導致被污染水體色度增大，進而影響水生動植物的生態平衡。而且，多數合成染料對動物和水生生物的毒害性較大，加之分子結構中多含有穩定性極強的苯環，導致其極難在環境中自然降解[1-2]。如何從廢水中移除合成染料已經成為科研工作者亟待解決的一個難題。在眾多不同種類的合成染料中，三苯甲烷類染料是印染行業中應用最為廣泛的一類染料，約占所有合成染料的30%～40%[3-4]。結晶紫（crystal violet，CV）是一類典型的三苯甲烷類染料，廣泛應用于印染、生物和醫學等各個領域。然而由于結晶紫的分子結構穩定，極難被微生物降解，導致其在環境水體中長時間存在，進而危害水生生物[5]。許多研究者嘗試用不同的處理方法移除廢水中的結晶紫染料，例如化學氧化還原法、物理沉淀或絮凝、光催化氧化、吸附、電化學處理、反滲透技術和生物降解等[5]。其中，生物降解作為一種環境友好型且高效低耗的處理手段而越來越受到廣泛的關注[6-7]。而國內外關于細菌降解結晶紫染料的研究報道較為少見。本研究從浙江溫州水頭皮革廢水重污染區域篩選到1株結晶紫高效降解菌株，在此基礎上，本研究旨在初步鑒定菌株CV-b，并采用單因素試驗研究該菌株對結晶紫的脫色特性以及脫色動力學。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種來源供試土樣取自浙江溫州水頭，菌株CV-b來源于皮革廢水底泥中。

1.1.2試劑結晶紫，購自國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染色液；TE緩沖液；Tris飽和酚（pH值8.0）；氯仿；10×PCR緩沖液、DNA 連接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）；DNA 純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司）等。其他生化試劑均為國產分析純。

1.1.3培養基無機鹽培養基（MSM，pH值7.0）：15.13 g/L Na2HPO4，3.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH4Cl，0.491 g/L MgSO4·7H2O，0.026 g/L CaCl2·2H2O。LB培養基pH值（7.0～7.2）：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl。純化培養基：在MSM培養基中添加終濃度為100 mg/L的CV染料。用于動力學研究的培養基（pH值6.2）：1.0 g/L木糖，1.0 g/L谷氨酸，0.5 mmol/L ZnCl2，50 mg/L CV。

1.2試驗儀器

超凈工作臺；電熱恒溫鼓風干燥箱；高壓蒸汽滅菌鍋；全溫恒溫搖床；電子天平；pH計；高速冷凍離心機；Evolution 300紫外可見光分光光度計；Bio-rad PCR儀；自動凝膠圖像分析儀及水平電泳儀等。

1.3試驗方法

1.3.1CV高效降解菌株的富集、分離和純化方法將10 g土樣置于100 mL無菌水中，在轉速為150 r/min的搖床中振蕩30 min后取出，待土水分離后，取10 mL上層懸液接入已滅菌的含10 mg/L CV為唯一碳源的MSM培養基（100 mL）中。于30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養1周后，吸取1 mL培養液轉接至含20 mg/L CV的新鮮培養基中，連續馴化、富集。轉接多次后，培養物可耐受的CV終濃度為100 mg/L。用接種環蘸取少許富集培養液，在純化培養基平板上直接劃線分離。在平板上選擇不同形態特征的單菌落，重新轉接至含100 mg/L CV的純化培養基平板上，轉接多次直至獲得單一形態的CV降解菌純培養物。

1.3.2菌株CV-b 16S rRNA基因的PCR擴增與序列分析具體方法參見都林娜等介紹的方法[8]。

1.3.3菌株CV-b對CV的脫色特性研究（1）培養基起始pH值對脫色的影響。用1.0 mol/L的HCl或NaOH將2.0 g/L酵母粉溶液的初始pH值分別調整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。滅菌后添加過濾除菌的CV，使其終濃度為50 mg/L，接種等量菌株CV-b過夜培養物（干質量，0.15 g/L），并于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養。（2）培養溫度對脫色的影響。分別設定培養溫度為15、20、25、30、35、40 ℃，pH值為7.0左右，接種培養方法同（1）。（3）碳氮源對脫色的影響。將供試碳源（葡萄糖、乳糖、D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-木糖和淀粉）分別添加至MSM培養基中，使其終濃度為 2.0 g/L。將供試氮源（NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸）分別添加至無NH4Cl的MSM培養基中，使其終濃度為20 g/L。接種和培養方法同（1）。（4）金屬離子對脫色的影響。分別向2.0 g/L的酵母粉溶液（pH值7.0）中添加終濃度為1.0、2.0 mmol/L的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，接種和培養方法同（1）。所有試驗均重復3次以上，并同時設置對照試驗。

1.3.4菌株CV-b對CV的脫色動力學研究接種后于30 ℃條件下培養，在一定的時間間隔內從三角瓶中吸取 4 mL 樣品，于10 000 r/min條件下離心10 min，上清液用于測定脫色率。

1.3.5菌株CV-b對CV脫色前后的全波長掃描分析在MSM培養基中添加終濃度為50 mg/L的CV，接種后于30 ℃條件下培養24 h后，取4 mL樣品，于10 000 r/min條件下離心10 min，上清液用Evolution 300紫外可見光分光光度計進行全波長掃描分析，同時設置對照試驗。

1.4脫色率計算

將混合培養物在10 000 r/min條件下離心10 min后，取上清，用Evolution 300紫外可見光分光光度計在580 nm（CV的λmax）處測定吸光度。對照試驗為同等條件下不接菌的試驗組。脫色率通過以下公式計算：

脫色率=Dc-DfDc×100%。

式中：Dc為對照試驗組的吸光度；Df為接種并培養一定時間后染料溶液的吸光度。

2結果與分析

2.1CV高效降解菌株的篩選與鑒定

經多次富集、純化培養后，篩選到一株對CV脫色效果較好的菌株，命名為CV-b。革蘭氏染色結果顯示該菌株是革蘭氏陰性菌，桿狀。

以菌株CV-b基因組為模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20進行PCR擴增，檢測PCR產物、回收、純化后測序，獲得1476 nt的CV-b菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登錄序號為KF956723。將該序列經與GenBank中的數據比對后發現，其相似度與Enterobacter sp. AP11的相似度達到97%以上，并且在系統進化樹中也與該菌株聚類在一起，表明該菌株屬于腸桿菌屬（Enterobacter sp.）。

2.2菌株CV-b對CV的脫色特性

2.2.1初始pH值對CV脫色的影響由圖1可知，培養 24 h 后，pH值在3.0～10.0之間時，該菌株對50 mg/L的CV脫色率均在50%以上，說明該菌株對CV脫色的pH適應性較強，實際應用潛力較大。同時，當培養基pH值偏酸性的情況下，該菌株對CV的脫色率仍較高，最適脫色pH值位于3.0～40之間。以往的報道顯示，多數菌株對染料進行脫色的最適pH值為中性范圍，如Ayed 等在研究Bacillus sp.菌株對CV的降解特性時發現，脫色的最適pH值為7.0左右，而偏酸或偏堿對脫色的抑制效果都較為顯著[9]；無獨有偶，胡起靖等在研究一株嗜麥芽寡養單胞菌對結晶紫的脫色條件時也發現，脫色的最適pH值為中性，偏酸或偏堿會對脫色有顯著的抑制效果[10]。與以往報道相比，菌株CV-b在偏酸或偏堿性條件下均有較好的脫色效果，pH適應性較強，能夠適應實際廢水處理過程中含染料廢水偏酸或偏堿的情況，故而實際應用潛能較大。

2.2.2溫度對CV脫色的影響由圖2可知，培養24 h時，溫度為25～35 ℃之間時，該菌株對50 mg/L的CV脫色率均在50%以上。隨著脫色時間的延長，菌株對CV的脫色率也隨之升高。

2.2.3碳氮源對CV脫色的影響試驗結果（圖3）表明，多數供試碳源對CV脫色無顯著影響或有促進效應，其中以麥芽糖、果糖和木糖的促進效果最為顯著，總體而言，供試碳源中以木糖對CV脫色的促進效果最好。不同的菌株對CV進行脫色的最適碳源不盡相同，多數研究中發現的CV生物脫色的最適碳源為葡萄糖，如Cheriaa等在研究Sphingomonas paucimobilis對CV脫色的過程中發現，脫色的最適碳源為葡萄糖[11]，而不同菌株對不同碳源的偏好性的原因尚不清晰。

氮源對CV脫色的影響如圖4所示。與碳源相比，多數供試氮源對CV脫色均無顯著影響或有顯著抑制效應，僅谷氨酸對脫色有顯著的促進效應。

2.2.4金屬離子對CV脫色的影響由圖5可知，無論濃度為1 mmol/L或2 mmol/L，在供試金屬離子中Ca2+、Mg2+和Mn2+均對CV脫色有顯著抑制效應，而Cu2+、Fe3+和Zn2+則對CV脫色有顯著促進效應，其中尤以Fe3+的促進效果最佳。但考慮到Fe3+本身有絮凝效果，且經離心后的菌體沉淀呈現紫色，因此，后期未在培養基中添加Fe3+作為脫色促進因子，而是選取了促進效果次之的Zn2+作為脫色促進因子。

2.3菌株CV-b對CV的脫色動力學特性

菌株CV-b對CV的脫色動力學試驗結果如圖6所示。由試驗數據可知，該菌株對CV脫色的動力學數據可以很好地擬合為如下動力學模型：y=4.672ln（t）+55.18（r2=0.942 7），y為脫色率，t 為脫色時間。此外，由圖6可知，經培養24 h后，該菌對50 mg/L的CV脫色率可以達到70%以上。根據以往報道，由于培養條件和接種量等差異，不同的菌株對CV的脫色率也各不相同，如Yatome等在研究Nocardia coralline 降解CV時發現，在CV濃度達到7 μmol/L（約3 mg/L）以上時，該菌株對CV的脫色就完全被抑制[12]；譙建軍等在研究細菌Kingella H共降解CV的動力學過程中發現，當CV濃度達到38 mg/L時，脫色率僅為30%左右[13]；Chen 等的研究表明，經過1周的培養后，菌株Pseudomonas putida 對 60 μmol/L （約25 mg/L）左右的CV脫色率為80%左右[5]；Cheriaa等發現Sphingomonas paucimobilis對50 mg/L CV的最高脫色率可達71.29%[11]。與以往報道相比而言，本研究中菌株CV-b脫色能力較強，且pH適應性強，應用前景較為廣闊。

2.4菌株CV-b對CV脫色前后的全波長掃描圖譜

前人研究表明，細菌對染料的脫色原因或是由生物降解引起，或是由生物吸附或富集引起。若經脫色后，染料的特征吸收峰完全消失且產生新的產物吸收峰，則脫色是由生物降解引起；而若經脫色后，染料全波長掃描圖譜中的吸收峰相應降低，但并不產生新的吸收峰，則脫色是由生物富集或吸附引起[14-15]。CV脫色前后的全波長掃描圖譜如圖7所示。結果顯示，經菌株CV-b脫色后，CV的特征吸收峰（λmax=580 nm）降低，且在紫外光譜區有新的產物吸收峰產生，因此，該菌株對CV的脫色主要由生物降解引起。

3結論

本研究從浙江溫州分離篩選到一株CV高效降解菌株CV-b，經鑒定屬于腸桿菌屬（Enterabacter sp.）。該菌株對CV進行脫色的pH適應性較強，脫色過程中對碳氮源的依賴性不高，且多數供試金屬離子對其脫色都沒有顯著的抑制效應，說明其實際應用潛力較大。另外，該菌株對CV脫色的動力學數據可以很好地用對數動力學模型進行擬合，經脫色前后的全波長掃描分析顯示該菌株對CV的脫色可能是由生物降解引起的。進一步的研究將圍繞該菌株對CV的降解機理和實際應用展開更加深入的探索。

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