牙齦卟啉單胞菌脂多糖對人牙周膜細胞成骨分化能力的影響

薛 棟，蔣少云，鄧嘉胤，董允允，張 蕊

（天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙周科,天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，天津300070）

人牙周膜細胞（humanperiodontalliga mentcells,HPDLCs）是包括了成牙骨質細胞、成骨細胞、成纖維細胞以及這些細胞的前體細胞或成體干細胞的特異性細胞群[1]，具有成纖維細胞樣和成骨細胞樣雙重特征，能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定，在細胞更新、組織修復以及組織再生中發(fā)揮重要的作用，具有干細胞的特性以及多向分化的潛能。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.g）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是牙周病重要的致病因子，其不僅能夠直接作用于牙周組織引起組織的破壞；同時，也是一種潛在的細胞活化因子，誘導細胞分泌多種炎性因子，在牙周病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本實驗通過體外P.gLPS刺激HPDLCs，觀察其對HPDLCs成骨分化的影響，同時探討P.gLPS對HPDLCs成骨分化的調節(jié)機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基、α-MEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；I型膠原酶、β-甘油磷酸鹽、地塞 米 松 、3 －（4，5 －dimethylthiazol－2 －yl）－2，5 －diphenyltetrazoliumbromide （MTT）、L-抗壞血酸（Sigma公司，美國）；PBS緩沖液；Trizol總RNA提取試劑（Invitrogen，美國）；cDNA逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒、real-timePCR試劑盒（Promega，美國）；P.gLPS（Invivogen，美國）；5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate/nitrobluetetrazolium(BCIP/NBT)溶液（華興博創(chuàng)生物，中國）。

1.2 HPDLCs體外培養(yǎng)[2-3]經患者知情同意，選取12～18歲因正畸治療需要拔除的新鮮健康的雙尖牙，PBS反復沖洗，刮取根中1/3牙周膜組織剪碎成1mm3小組織塊，采用I型膠原酶+組織塊法進行HPDLCs的原代培養(yǎng)，待細胞從組織塊中爬出并達80%匯合時，進行首次傳代，取第3～4代細胞用于實驗。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將細胞分為3組進行實驗。A組：含5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HPDLCs；B組：成骨誘導培養(yǎng)（含10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 μg/mL維生素 C、1×10-8mol/L地塞米松、5%胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)液）培養(yǎng) HPDLCs；C 組：1μg/mLP.g LPS+成骨誘導培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測HPDLSCs的增殖能力 依照上述分組，將HPDLCs接種于每孔2×103個細胞的96孔培養(yǎng)板內。每組分別設5個復孔，隔天換液。用0.5mg/mLMTT檢測細胞增殖活性，37℃孵育4h后，于波長490nm測各孔光密度（opticaldensity，OD）值。

1.3.3 堿性磷酸酶染色 將HPDLCs以5×104/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，棄原培養(yǎng)液，依照上述分組分別加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)7d后，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌2～3遍，每孔加入1mL BCIP/NBT工作液，室溫避光放置15min，PBS洗滌2～3遍，觀察染色情況。

1.3.4 茜素紅染色以及茜素紅半定量檢測 培養(yǎng)同上，第21天后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌2～3遍，加入0.1%茜素紅（alizarinred-S），室溫放置 30min，PBS 清洗 2～3遍，拍照觀察。照相后，吸棄PBS，每孔加入1mL氯化十六烷吡啶，室溫放置15min，將溶液移入96孔板，150μL/孔，酶聯(lián)免疫檢測儀于波長562nm檢測OD值。

1.4 Real-timePCR檢測成骨相關基因的mRNA表達 分組同前。分別于第3、7及14天采用Trizol總RNA法提取各組細胞RNA，參照試劑盒說明書合成cDNA模版，用獲得的cDNA進行real-timePCR檢測成骨相關基因：I型膠原蛋白（collagen1，COL1）、堿性磷酸酶（alkalinephophatase，ALP）、Runt相關轉錄因子（runt-relatedtranscriptionfactor2，RUNX2）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）。其引物序列見表1。以GAPDH作為組內對照，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法進行處理。

表1 合成引物序列及聚合酶鏈反應產物長度Tab1 Primerse quences and the length of poly merase chainreaction products

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件，采用單因素方差分析（one-wayANOVA）對所得數(shù)據(jù)分別進行方差分析，并用Bonferroni法進行多樣本均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPDLCs的培養(yǎng) 原代細胞培養(yǎng)5～9d時，組織塊周圍有細胞爬出，3周左右可達80%匯合。細胞呈長梭形、多邊形等，胞質形成的突起向外呈放射狀（圖1）。

圖1 體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞（×100）Fig1 Humanperi odontalliga mentcell sculture dinvitro（×100）

2.2 HPDLCs的增殖能力 第3～5天，B組與C組的OD值低于A組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且B組與C組間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。隨后，A、B及C3組間均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）（圖2）。

2.3 P.gLPS刺激后堿性磷酸酶染色結果 第7天B組與C組的堿性磷酸酶活性均明顯強于A組，而且B組的染色最明顯（圖3）。

圖23 組不同培養(yǎng)條件下HPDLCs的增殖能力Fig2 Proliferation of HPDL Csinthreegroups

圖3 堿性磷酸酶染色Fig3 Alkaline phosphatas estaining

2.4 P.gLPS刺激后茜素紅染色和茜素紅半定量檢測的結果 21d后茜素紅染色，與A組相比，B組與C組均可見茜素紅染色陽性礦化結節(jié)形成（圖4）。茜素紅染色定量結果顯示，B組與C組的OD值均明顯增高（圖5），其差異與A組具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但C組的OD值明顯低于B組，且差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖4 茜素紅染色Fig4 Alizarinre dstaining

2.5 P.gLPS刺激后real-timePCR檢測成骨相關基因的表達水平

2.5.1 COL1mRNA的表達 在第3、7、14天，與A組相比，B組與C組COL1表達均升高（P<0.05），而C組較B組COL1表達降低，其差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖 6）。

圖5 茜素紅染色定量檢測Fig5 Quantitative detection of alizarinre dstaining

圖6 Real-timePCR測定COL1mRNA水平Fig6 The expression of COL1mR NAinHPDLCs

2.5.2 ALPmRNA的表達 在3、7、14d，與 A組相比，B組與C組ALP表達均升高（P<0.05）；但在3d時，B組與C組間ALP表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05），而在7d及14d時，C組ALP表達明顯低于B 組，且具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）（圖 7）。

圖7 Real-timePCR測定ALPmRNA水平Fig7 The expression of ALPmR NAin HPDLCs

2.5.3 RUNX2mRNA的表達 與A組相比，B組與C組RUNX2表達明顯升高（P<0.05），且呈時間依賴性，隨著時間的延長其表達更明顯；同時C組較B組 RUNX2表達顯著降低（P<0.05）（圖8）。

圖8 Real-timePCR測定RUNX2mRNA水平Fig8 The expression of RUNX2m RN Ain HPDL Cs

2.5.4 OCNmRNA的表達 3d時，與A組相比，B組與C組OCN表達升高，但兩兩比較時C組與A組間無統(tǒng)計學差異（P>0.05），B組與A組間有統(tǒng)計學差異（P<0.05），C組較B組OCN表達明顯減少（P<0.05）；在7d及14d，B組與C組OCN表達均較A組升高（P<0.05），而且C組較B組OCN表達明顯減少（P<0.05）（圖 9）。

圖9 Real-timePCR測定OCNmRNA水平Fig9 The expression of OCNm RNAin HPDL Cs

3 討論

牙周膜細胞是牙周及根尖周組織中的主要細胞成分，其在牙周支持組織的發(fā)育、修復以及再生的過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明HPDLCs具有成骨的能力，能表達較高的ALP水平，產生較高的與礦化相關蛋白質及I型膠原等[4]，因此牙周膜細胞被認為是研究牙周組織修復重建的重要細胞之一。本研究通過ALP染色、茜素紅染色以及成骨相關基因的檢測進一步證實了牙周膜韌帶細胞具有成骨分化的能力。

張鳳秋等[5]研究牙周優(yōu)勢菌內毒素對HPDLCs增殖的影響發(fā)現(xiàn)，當P.gLPS濃度小于0.1μg/mL時促進HPDLCs增殖，濃度在1μg/mL時對細胞增殖無明顯影響，而當其濃度大于10μg/mL時則可抑制HPDLCs的生長。同時也有研究表明P.gLPS濃度低于0.1μg/mL時對HPDLCs既無增殖也無抑制作用，而濃度達1μg/mL時對HPDLCs有明顯抑制作用[6]。筆者前期實驗表明，當P.gLPS濃度為10μg/mL可明顯抑制HPDLCs的增殖，這與部分學者的報道一致[5-6]。而1μg/mLP.gLPS對細胞增殖無明顯影響。為排除細胞增殖的改變對細胞分化結果的影響，本研究以此濃度建立炎癥狀態(tài)下細胞骨向分化模型。

ALP是參與骨等礦化組織代謝以及再生的標志性酶，其表達的增多或降低是決定骨礦化程度是否良好的關鍵條件[7]。本實驗通過ALP染色以及實時定量PCR顯示，當P.gLPS刺激后，ALP的mRNA表達較單純成骨誘導組降低，從而導致ALP活性下降，提示P.gLPS降低了HPDLCs成骨分化的礦化程度，從而影響了牙周組織的修復及改建過程。

COL1是成骨細胞分化過程中的重要基質，為組織的礦化提供基礎。從筆者的研究結果顯示，P.g LPS降低COL1的表達，使得細胞分化、組織礦化過程中的礦化基質降低，從而干擾礦化過程。茜素紅染色結果顯示礦化結節(jié)在P.gLPS刺激下明顯減少，可能是由于礦化基質的減少所致。Viale-Bouroncle等[8]研究結果顯示，COL1促進牙囊細胞表達ALP，但是不刺激其礦化過程。因而推測，在本研究中ALP的下降有可能與COL1降低有關，但因細胞的種類不同需要進一步驗證。

間充質干細胞細胞的成骨分化是由特定的轉錄因子調控。在非成骨細胞及成纖維細胞中過表達RUNX2能夠誘導成骨相關基因的表達，RUNX2作為成骨特異性激活因子，在成骨細胞發(fā)育、分化以及骨形成與重建過程中起到重要的作用[9-11]。在P.g LPS刺激后細胞中RUNX2的表達明顯下降，從而干擾了細胞的成骨向分化。

OCN是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，能夠反映骨形成的速率，是骨細胞活性和骨代謝的特異性指標；其維持骨正常的礦化速率，抑制異常羥基磷灰石結晶的形成，抑制軟骨的礦化速率[12-14]。Pacios等[15]研究伴放線桿菌引起的牙周炎癥糖尿病動物模型中發(fā)現(xiàn)，在使用抗生素治療后OCN表達升高，說明在炎性狀態(tài)下，OCN的水平降低，導致牙周骨組織的形成減少，阻礙了正常的骨改建過程。本實驗中，P.gLPS刺激能使OCNmRNA的表達較單純成骨誘導組降低，可見P.gLPS干擾了HPDLCs的成骨礦化過程，降低了其骨形成的速率。

炎性微環(huán)境下HPDLCs的成骨分化功能受多方面調控。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥組織來源的PDLCs成骨分化能力較健康組織來源的PDLCs明顯降低[16]。Gilbert等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-a）可能通過作用于胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）I，骨形成蛋白（bonemorphogenic proteins，BMP）-6 或骨骼肌 LIM蛋白（skeletal LIM protein，LMP）-1表達的遠端，從而抑制細胞的成骨分化。在我們課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)P.g LPS能刺激人牙齦成纖維細胞分泌TNF-α、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[18]，而且其他學者也證實牙周致病菌及P.g LPS能刺激HPDLCs分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8[19]，筆者推測，可能是P.g LPS改變了HPDLCs生存的微環(huán)境，產生了過多的炎性細胞因子，這些細胞因子對細胞的成骨分化產生抑制作用。本實驗通過研究HPDLCs在炎性狀態(tài)下成骨分化能力的變化，提出炎性狀態(tài)下外界刺激可能通過負調節(jié)HPDLCs中骨相關基因的表達，從而抑制其成骨分化能力，進一步降低牙周組織的自我修復和重建能力，從而說明了消除炎癥是促進牙周組織再生的必需條件。

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