4種方法制備外周血淋巴細胞總RNA對鵝α干擾素的影響比較

王永娟　王岑　朱善元　左偉勇

摘要：無菌采取鵝外周血并進行抗凝處理，以全血提取法、細胞分離直接提取法、細胞分離培養(yǎng)提取法及細胞分離誘導提取法分別提取外周血中淋巴細胞的總RNA；紫外分光光度計檢測總RNA的純度和得率；以總RNA為模板通過RT-PCR法擴增鵝α-干擾素（GoIFN-α）基因，并構建重組質(zhì)粒pGEMT-α，通過比較GOIFN-α序列確定各種提取方法的可行性。結果顯示，4種方法提取的RNA純度高，均可作為模扳擴增出目的基因，滿足后續(xù)的分子生物學研究；其中以細胞分離直接提取法制備的RNA產(chǎn)量最多，此結論為外周血淋巴細胞總RNA的提取提供了一種更快捷的方法。

關鍵詞：外周血；淋巴細胞；RNA提?。籖T-PCR；方法比較；鵝；干擾素

中圖分類號：S858.33 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0204-02

干擾素是真核細胞對各種刺激作出反應而自然形成的一組復雜且具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。刺激產(chǎn)生干擾素的外源因素主要有病毒和其他種類的干擾素誘導劑，如植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）。在外源因素刺激下，原處于Go期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，從而獲得豐富的含有絲分裂且生長活躍的細胞群體，終止分裂中期的淋巴細胞，提取總RNA并反轉錄，即可得到1個表達細胞因子的cDNA庫。多個報道顯示，為獲取目的基因，一般在外源因素刺激后再提取外周血淋巴細胞總RNA，本研究嘗試采用多種方法制備總RNA并擴增目的基因，以探索一種最為快捷簡便的外周血淋巴細胞總RNA提取方法，為其他細胞因子的分離奠定基礎。

1.材料和方法

1.1試驗材料

成年揚州白鵝購自揚州瑞農(nóng)科技有限公司；刀豆球蛋白（conA）購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；禽淋巴細胞分離液購白天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase、RNaseInhibitor、TaqDNA聚合酶、1kbDNALadderr、PrestainedProtein分子量marker、pGEM-TEasyVectorSystem、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Promega公司；膠回收試劑盒、細胞培養(yǎng)液、細胞消化液、DH5cα大腸桿菌感受態(tài)細胞購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2引物設計與合成

根據(jù)已發(fā)表的GoWN-α基因序列（登錄號：HQll5583）設計1對引物，擬擴增的全長序列為576bp。引物F1：5'-ATGCCTGGGCCATCAGCCCCAC-3'和R1：5'一TTAGCGCAT—GGCGCGGGTGAGG-3'由上海Invitrogen公司合成。

1.3總RNA提取

1.3.1細胞分離誘導提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，加入含10%小牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液并吹勻，計數(shù)后稀釋至2×10⁶個/mL。用終濃度64mg/LConA刺激誘導，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，收集細胞并按Trizol試劑說明書提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.3.2細胞分離培養(yǎng)提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翅靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，后將其重懸于含10%小牛血清的RPMI一1640細胞培養(yǎng)液中，計數(shù)后稀釋至2×10⁶。個/mL，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按Trizol說明書提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.3.3細胞分離直接提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，用PBS重新懸浮，反復洗滌2～3次后按Trizol說明書提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.3.4全血提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按Trizol說明書直接提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.4GoIFN-α基因的RT-PCR擴增

GOIFN-α基因的反轉錄（RT）：取上述4種RNA懸浮液各5μL，參照反轉錄酶說明書，均選用特異性引物R1分別合成cDNA第1鏈，RT產(chǎn)物各自標記岳于20℃保存。

GolFN-α基因的PCR擴增：取上述4種RT產(chǎn)物各2μL為cDNA模板，分別加入MixTaqDNA聚合酶25μL，上、下游引物（F1、R1）各1μL，超純水補足至各反應體系均50μL，混勻后參照下列反應程序進行PCR擴增。反應程序：95℃預變性3min；95℃30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，28個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物各取5μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝皎電泳初步鑒定片段大小。

1.5Gol-α基因的克隆與鑒定

將上述4種經(jīng)凝皎電泳鑒定后的PCR產(chǎn)物用皎回收試劑盒純化回收，并分別與pGEMT-easy載體進行連接，按照常規(guī)方法轉化DH5c～感受態(tài)細胞后進行藍白斑試驗，提取重組質(zhì)粒并作酶切鑒定。將陽性GoLFN-α全基因重組質(zhì)粒送至上海立菲生物技術公司測序。

2.結果與分析

2.1總RNA純度與濃度測定

紫外分光光度儀分別測定4種不同方法提取的總RNA純度和濃度，結果見表1，其中D260nm/D280nm值反映總RNA的純度。

2.2GoLFN-α全基因的擴增

對上述4種方法所得的揚州鵝外周血總RNA，采用體積及反應條件完全相同的反應組分進行反轉錄。之后在相同條件下進行全長GolFN-α基因的PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，均獲得了符合預期大小的約576bp的條帶（圖1）。endprint

2.3GoLFN-α全基因克隆與鑒定

將各PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體，分別用限制性內(nèi)切酶SalI或EcoRI對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2（以細胞分離直接提取法所得GolFN-α基因重組為例），均出現(xiàn)預期大小的DNA條帶，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-α。

2.4GolFN-α基因序列測定

將各種方法所對應的重組質(zhì)粒pGEMT-α>送至上海立菲生物技術公司測序，結果見表2-4種方法制備的GoLFN-α序列同源性為100.0%，與參考序列的同源性為99.7%。

3.結論與討論

本研究通過4種方法制備鵝外周血淋巴細胞總RNA并擴增目的基因GolFN-α，結果顯示，各種方法所制備的總RNA均可擴增出預期的目的基因，其中以“細胞分離直接提取法”所得總RNA濃度最高，同等條件下所得目的基因產(chǎn)量也最多。此結果提示我們：從外周血淋巴細胞中分離細胞因子，可以避開以往的細胞分離誘導提取法，改用無需誘導劑的細胞分離直接提取法，既高效又快捷，且能滿足后期的分子生物學研究。另外，全血提取法在不分離淋巴細胞的情況下直接提取，同樣獲得了目的基因，因此在對目的基因無產(chǎn)量要求的情況下全血提取法也是很好的選擇。

本研究中的全血提取法、細胞分離培養(yǎng)提取法及細胞分離直接提取法均未涉及到淋巴細胞的誘導，但卻成功獲得了目的基因，究其原因可能是所采鵝已受到外來病毒的感染，外周血淋巴細胞已轉化為具有分化能力的淋巴母細胞，因此，分離的外周血細胞就算沒有刺激也可以達到預期目的。其中細胞分離直接提取法，淋巴細胞已從全血中分離出來卻又未經(jīng)培養(yǎng)，淋巴細胞密度大、活性高，因此同等條件下總RNA和目的基因產(chǎn)量均最高。而全血提取法可能含其他細胞RNA量較多，故出現(xiàn)總RNA產(chǎn)量高、目的基因產(chǎn)量不高的局面。

本研究各種方法獲得的GolFN-α基因序列與GenBank中已發(fā)表的GolFN-α基因序列（登錄號：HQll5583）同源性達99.7%，說明該基因相對保守，證實了禽IFN-α基因序列保守性良好、遺傳進化變異緩慢的觀點。

綜上所述，細胞分離直接提取法可以替代甚至優(yōu)于之前常用的誘導法以實現(xiàn)畜禽細胞因子的分離擴增；全血提取法操作簡單，在對目的基因無產(chǎn)量要求的情況下也可運用。endprint