某省戶籍孕婦地中海貧血的產前篩查及產前診斷的實驗研究

戴　薇　許　吟　馬星衛　張有成　黃盛文*

（貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550002）

某省戶籍孕婦地中海貧血的產前篩查及產前診斷的實驗研究

戴薇許吟馬星衛張有成黃盛文*

（貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550002）

目的 探討貴州省戶籍孕婦地貧的分子缺陷情況，探索可用于臨床一線的地貧產前篩查指標和產前診斷技術，并將其應用于貴州省地貧孕婦的產前篩查和產前診斷中，以降低我省重癥地貧患兒出生率，提高人口質量。方法 選擇在貴州省人民醫院進行產前檢查孕18周以前的貴州省戶籍孕婦1089例，分析紅細胞指標（RBC、Hb、MCV、MCH）和血紅蛋白電泳（Hb A2）值，異常者納入疑似病例；篩查出雙方均有地貧表型陽性的夫婦，提取基因組DNA，gap-PCR法同時檢測-α3.7、-α4.2和--SEA/αα 3種最常見的α-地貧缺失突變類型，RDB法檢查中國最常見的17種β-地貧突變基因和3種α-地貧突變基因，確定基因型；雙方確定為同型地貧的夫婦，經知情同意后，孕婦于16～24周行羊膜穿刺抽取羊水20mL，常規提取胎兒基因組DNA，用上述基因檢測方法檢測胎兒是否地貧。如胎兒為輕型地貧，可向孕婦提出合理化建議。如胎兒為中重型地貧，建議孕婦終止妊娠；分娩后取胎兒組織提基因組DNA，檢測地貧基因型以進一步證實產前診斷的結果。結果 ①紅細胞指標和血紅蛋白電泳初步篩查地貧孕婦78例，初篩陽性率7.16%（78/1089）；基因診斷確診53例，篩查陽性確診率67.9%（53/78）。②兩種地貧孕婦的RBC均高于正常孕婦（P＜0.01）。③兩種地貧的Hb、MCV、MCH均低于正常孕婦（P＜0.01）。④α-地貧孕婦的Hb高于β-地貧孕婦（P＜0.01），而Hb A2低于β-地貧孕婦（P＜0.01）。⑤α-地貧20例，發生率1.84%（20/1089），β-地貧33例，發生率3.03%（33/1089）。⑥本實驗中貴州戶籍孕婦α-地貧最常見的基因型是--SEA/αα，β-地貧最常見的基因型是17/N。⑦7例孕婦羊水穿刺檢測胎兒地貧基因，6例與胎兒臍血檢測結果一致（1例仍在妊娠）。結論 ①孕早中期的孕婦進行紅細胞指標和血紅蛋白電泳檢查可以初步篩查地貧并初步區分地貧類型。②貴州省戶籍孕婦β-地貧發生率較α-地貧發生率高，β-地貧最常見的基因型是17/N，α-地貧最常見的基因型是--SEA/αα。③地貧羊水基因診斷符合率高，我省孕婦可以將地中海貧血的篩查作為常規產前檢查。

地中海貧血；產前篩查；產前診斷

地中海貧血（簡稱地貧）是人類最常見的一種隱性的單基因遺傳性血紅蛋白疾病。中國南方是地中海貧血高發區［1］。地貧具有先天性、終身性和家族遺傳性的特點。目前，尚無理想的治療方法，患者需終身忍受疾病痛苦或幼年夭折，且通常需付出高昂的代價。地貧是通過基因攜帶者的生殖行為而發生，一般措施不能阻斷其向后代傳遞。故盡早發現和及時終止妊娠是唯一途徑［2］。早期行產前遺傳學診斷是當今國內外產科領域的一個熱點課題。我省的地中海貧血研究自2006年以來研究主要集中在β-地中海貧血的血液篩查和部分地區少數民族的β-地中海貧血調查上。為提高我省產前保健質量，實現生育人群的α及β地貧產前篩查，降低甚至杜絕重癥地貧患兒的出生，本文通過血液學表型分析篩查地貧基因攜帶者，對可疑患者檢測常見的α地貧缺失基因型，β地貧突變基因型，αCS、αQS、αWS 3種常見的α-珠蛋白基因點突變，為臨床大規模篩查提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1研究對象：在貴州省人民醫院進行產前檢查孕18周以前的貴州省戶籍孕婦1089例。

1.2方法：孕婦在知情同意情況下抽取外周血3管，查紅細胞指標和血紅蛋白電泳。指標正常者排除，指標異常者進一步行地貧基因檢測。地貧基因攜帶孕婦者配偶在知情同意情況下抽取外周血3管，查紅細胞指標和血紅蛋白電泳。指標正常者排除，指標異常者進一步行地貧基因檢測。雙方均為地貧攜帶者胎兒16～24周抽羊水進行地貧基因檢測。

1.2.1篩查方法：MCV＜82 fL和（或）MCH＜27 pg，Hb A2＜3.0%和Hb F≤2.0%，判斷為α-地貧表型陽性。Hb A2≥3.5%和Hb F≤2.0%或增加，判斷為β-地貧表型陽性。

1.2.2檢測方法。①血液樣本及羊水樣本DNA的提取：按試劑盒操作說明提取基因組DNA。②α地貧缺失型的基因檢測方法：α-地貧缺失型的診斷按α-地中海貧血基因診斷試劑盒操作說明，應用gap-PCR技術，檢測正常α基因和--SEA（東南亞缺失）、-α3.7（右缺失）、-α4.2（左缺失）三種常見α地貧缺失型。③α、β地貧非缺失型的基因檢測方法：按基因診斷試劑盒操作說明，應用PCR-RDB技術檢測αCS、αQS、αWS3種常見非缺失型α地貧，同時檢測中國人群常見的8個位點［CD41-42（-TCTT），IVS-2-654 C→T，CD17A→T，-28 A→G，CD26G→A，CD71-72（+A），CD43G→T，-29A→G］和9個少見位點突變［起始密碼子ATG→AGG，CD14-15（+G），CD27-28（+C），-32 C→A，-30 T→C，IVS-1-1 G→T，IVS-1-5 G →C，CD31（-C），CAP+40-+43（-AAAC）］。

1.3統計分析：采用SPSSl3.0軟件，進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結 果

2.1血液篩查結果：在貴州省人民醫院進行產前檢查孕18周以前的貴州省戶籍孕婦1089例，紅細胞指標及血紅蛋白電泳異常納入疑似病例，納入疑似地貧78例，初篩陽性率7.16%（78/1089）；基因診斷確診53例，篩查陽性確診率67.9%（53/78）。兩種地貧孕婦的RBC均高于正常孕婦，而Hb、MCV、MCH均低于正常孕婦。α-地貧孕婦的Hb高于β-地貧孕婦，而Hb A2低于β-地貧孕婦。

2.2基因診斷結果：孕婦確診α地貧20例、β地貧33例。α地貧發生率1.84%（20/1089），β地貧發生率3.03%（33/1089）；夫婦同患α地貧1例，夫婦同患β地貧4例；重型地貧患兒1例（引產后再次行臍血基因診斷，符合率100%）。53例地貧孕婦的基因型分布。20例α-地貧中，以基因型為--SEA/αα的標準型最多，占60.0%。33例β-地貧均為輕型，基因型以17/N最多，占45.5%，其次是41-42/N和IVS-Ⅱ-654/N，分別占27.3%和18.2%。見圖1、2。

圖1　M：gap-PCR的DNA分子量標準；4、11號正常：αα/αα；3、9號：-α3.7/αα；5號：-α4.2/αα；1、2、6、7、8、10、12號：--SEA/αα

圖2　孕婦-αCS/αα雜合子

2.37例羊水穿刺產前診斷的基因檢測結果：本實驗中篩查出5例同型地貧高危夫婦，其胎兒有1/4概率為重癥地貧，遂行羊水穿刺產前診斷。2例篩查出為17/N的孕婦，配偶正常，理論上胎兒不會出現重癥地貧，仍自愿要求行產前診斷。羊水穿刺后基因檢測結果顯示2例均為N/N。新生兒出生后再次臍帶血基因檢測，與產前診斷結果完全符合。見圖3。

圖3　①孕婦CD41-42雜合子；②丈丈IVS-Ⅱ-654雜合子；③胎兒41-42/IVS-Ⅱ-654雙重雜合子

2.45個高危家庭的妊娠結局：孕婦5孕β0/β+（41-42/654-Ⅱ）中重型β地貧胎兒，家屬簽知情同意書后引產，再次臍血地貧基因檢測與產前診斷相符。孕婦1、孕婦3和孕婦4足月妊娠分娩后，臍血地貧基因檢測與產前診斷相符。孕婦2仍在妊娠中。

3　討 論

血紅蛋白由四條珠蛋白鏈組成，其中包括兩個α類亞基和兩個β類亞基。地中海貧血是由于珠蛋白基因發生突變，導致相應珠蛋白鏈合成不足，紅細胞破裂從而引發溶血性貧血的一組遺傳性血液病；也是最早在分子水平闡述其病理學機制的人類遺傳病之一。血紅蛋白鏈位置分α、β、γ、δ、β等類型，以α、β地貧最常見。目前全球已鑒定的α-地中海貧血缺失基因超過20種，中國人最常見的是（--SEA/），（-α3.7/）和（-α4.2/）。在中國報道的β-珠蛋白基因突變引起的β地中海貧血有48種，其中中國南方報道有46種。CD41-42（-TCTT），IVS-2-654 C→ T，CD17A→ T，-28 A→ G，CD26G→ A，CD71-72（+A），CD43G→ T，-29 A→G 8種突變占了全部突變類型的90%以上［3］。產前篩查、遺傳咨詢、產前診斷對降低該病的發生率至關重要，目前實驗室主要有篩查法和基因檢測法兩大類［4］。

通過孕婦產前檢查血常規中的紅細胞指標和血紅蛋白電泳進行篩查，既簡單又經濟并且容易推廣。地中海貧血表型變化的嚴重程度與其染色體的單倍型密切相關，有研究表明α-地貧復合β0-地中海貧血比單純的β0地中海貧血雜合子的血液血表型變化要稍輕一些［5］。本試驗得出α-地貧孕婦的Hb要高于β-地貧孕婦，這種差別的具體原因還需要進一步探索。β-地貧孕婦Hb A2的含量明顯高于α-地貧孕婦，因此Hb A2是區分二者的有效指標。本研究借助目前的實驗篩查聯合基因檢測技術，旨在探索地貧產前篩查和產前診斷的可行性，進一步大力推廣地貧篩查、檢出高危人群，實現準確診斷攜帶者和適時產前診斷，以科學有效地防治地貧，消滅重癥地貧，切實搞好優生優育。

［1］ 徐湘民.地中海貧血預防控制操作指南［M］.北京：人民軍醫出版社，2011.

［2］ Dongzhi L，Can L，Jian L，et a1.Prenatal diagnosis of β-thalassemia in Southern China［J］.Eur J Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biol，2006，128（1-2）：81-85.

［3］ 劍英，謝杏梅，李東至，等.廣州地區產前檢查人群地中海貧血流行病學分析［J］.中國優生與遺傳雜志，2013，21（2）：68-69.

［4］ 王燕燕，李曉輝，徐西華.地中海貧血診治進展與我國現狀［J］.中國實用兒科雜志，2013，28（6）：473-476.

［5］ 龐江琳，陳杰，陳碧.粵西地區β地中海貧血流行病學調查［J］.中國優生與遺傳雜志，2012，20（6）：24-25.

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1671-8194（2015）09-0062-02