蓬莪術多糖體外抗氧化活性研究

茍學梅，王　茜，高　剛，周永紅，楊瑞武，*

（1.四川農業大學生命科學學院，四川雅安625014；2.四川農業大學小麥研究所，四川溫江611130）

蓬莪術多糖體外抗氧化活性研究

茍學梅1，王茜1，高剛1，周永紅2，楊瑞武1，*

（1.四川農業大學生命科學學院，四川雅安625014；2.四川農業大學小麥研究所，四川溫江611130）

以多年生草本藥用植物蓬莪術根莖為原材料，熱水浸提法提取多糖，測定蓬莪術多糖的總糖含量、糖醛酸含量和蛋白質含量，并對蓬莪術多糖結構進行紅外光譜分析。通過體外抗氧化實驗研究蓬莪術多糖對自由基的清除能力以及總還原能力。結果表明，蓬莪術多糖的總糖質量分數為56.13%，糖醛酸質量分數為8.65%，蛋白質質量分數為4.53%。體外抗氧化活性研究結果表明對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子有明顯清除作用和較強的還原能力，其清除自由基的IC50值分別為0.29、0.44、0.36mg/mL。

蓬莪術，多糖，抗氧化

近年來對藥用植物的研究發現，其含有豐富的多糖類物質，是中醫和中藥應用的重要物質成分。研究表明，藥用植物多糖具有免疫調節［1-2］、抗腫瘤［3］、抗病毒［4］、抗輻射［5］及降血糖［6］等方面有眾多藥理功能，且無毒副作用，有“生物反應調節劑（biological response modifier，BRM）”［7］之稱。因此從藥用植物中提取具有生物活性的多糖類物質，具有重要意義和較好的研究前景。

蓬莪術（Curcuma phaeocaulis Valeton）是2010年版《中華人民共和國藥典》收載的3種基原莪術中的一種，是姜科姜黃屬的多年生草本植物，為川產道地藥材［8］。中醫認為蓬莪術有破淤、行氣、消積和止痛的功效［9］；還有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等活性［10］。蓬莪術的主要有效部位為根莖，其主要活性成分是揮發油和多糖。蓬莪術揮發油具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血等作用［11］，已廣泛應用于臨床。目前有關蓬莪術的研究主要集中在莪術油的藥效物質基礎和臨床應用開發上。然而關于蓬莪術多糖的物理化學性質以及清除自由基活性方面的研究尚未見報道。因此，本實驗從蓬莪術根莖中提取多糖，考察其理化性質和體外抗氧化活性，為蓬莪術資源的綜合利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試材料采集于四川雙流，由四川農業大學生命科學學院楊瑞武教授鑒定為蓬莪術（Curcumaphaeocaulis Valeton），洗凈于50℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，干燥保存備用；抗壞血酸（VC） 成都科龍化工試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH） 美國Sigma公司；重蒸酚國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸、無水乙醇、石油醚（60～90℃）、葡萄糖等所用其他試劑均為分析純；本實驗用水均為自制雙蒸水。

FW 80型中草藥粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司；HWSY 11-K型電熱恒溫水浴鍋北京市長風儀器儀表有限公司；RB-52AA型真空旋轉蒸發儀上海亞榮生化有限公司；H-1650型離心機長沙湘儀儀器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱天津泰斯特儀器有限公司；UV-3200PC型紫外分光掃描儀上海美譜達儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1多糖的提取及純化準確稱取100g的蓬莪術粉末分別經石油醚和無水乙醇索氏提取5h至無色，烘干得預處理粉末。準確稱取50g預處理粉末，在預實驗的基礎上按料液比1∶30加入水，在90℃提取4h，重復提取兩次合并濾液，旋轉蒸發濃縮至400m L后加入95%乙醇至乙醇最終濃度為80%（v/v），于4℃下醇沉24h，離心，沉淀即為蓬莪術粗多糖。將粗多糖溶于50m L雙蒸水中，采用Sevage法（氯仿∶正丁醇=4∶1，v/v）［12］除去糖液中的蛋白，重復多次，然后流水透析24h，蒸餾水透析48h，濃縮透析袋內糖液，冷凍干燥，得蓬莪術多糖（CPP）。

1.2.2化學組成

1.2.2.1CPP總糖含量的測定CPP的糖含量采用苯酚硫酸法［13］測定，以干燥葡萄糖為標準品。

標準曲線的建立：準確配制0.40mg/m L葡萄糖標準溶液以及6%的苯酚溶液。分別精密吸取葡萄糖標準溶液1.0～10.0m L至10.0m L容量瓶中加水定容。精密移取各梯度濃度溶液2.0m L于20m L具塞試管中，依次加入1m L 6%的苯酚溶液和5m L濃硫酸，振蕩混勻，沸水浴30min。冷卻至室溫后在490nm處測定吸光值。以吸光值為縱坐標，對應的葡萄糖濃度（mg/m L）為橫坐標制作標準曲線。以超純水替代標準品溶液作為空白對照，每組實驗平行3次。標準曲線方程為：y=0.0129x-0.0073，R2=0.9998。

樣品的測定：配制樣品溶液，按照制作標準曲線的操作進行樣品的測定，每組實驗平行3次，求取平均值，通過樣品溶液的吸收值，根據標準曲線回歸方程求出樣品中葡萄糖的含量，按照下式計算各樣品中總糖含量：

式中，c為樣品測定液中葡萄糖的質量濃度（mg/m L）；d為測定液的稀釋倍數；v為測定液的總體積（m L）；m為稱取的樣品質量（g）。

1.2.2.2糖醛酸含量測定糖醛酸含量采用硫酸咔唑法［14］測定，以半乳糖醛酸作為標準品。

標準曲線的建立：準確配制濃度為1.0mg/m L的半乳糖醛酸標準溶液。分別吸取0.02～0.1m L的半乳糖醛酸標準溶液置于試管中，補水至1m L。然后緩慢加入6m L硫酸-硼砂溶液，混合均勻后沸水浴5m in。冷水浴冷卻至室溫后分別加入0.2m L 0.1%的咔唑無水乙醇溶液，沸水浴10m in后取出，冷卻至室溫后在530nm波長下測定吸光值，以吸光值為縱坐標，對應的半乳糖醛酸濃度（mg/m L）為橫坐標制作標準曲線。以超純水替代標準品溶液作為空白對照，每組實驗平行3次。標準曲線方程為：y=9.6514x+0.0011，R2= 0.9987。

樣品的測定：配制樣品溶液，按照制作標準曲線的操作進行樣品的測定，每組實驗平行3次，求取平均值，通過樣品溶液的吸收值，根據標準曲線回歸方程求出樣品中糖醛酸的含量，按照下式計算樣品中糖醛酸的含量：

式中，c為供試液中糖醛酸質量濃度（mg/m L）；d為測定液的稀釋倍數；v為測定液的總體積（m L）；m為供試樣品的質量（mg）。

1.2.2.3蛋白質含量測定蛋白質含量采用王文平的方法［15］測定，以牛血清白蛋白為標準品。

標準曲線的建立：準確配制濃度為100μg/m L牛血清白蛋白標準液，分別精密移取0.2～1.0m L牛血清白蛋白標準溶液于10m L具塞試管中，各管補水至1m L，然后分別加入5m L考馬斯亮藍G-250試劑，常溫下靜置15m in，待顏色穩定后，在595nm處測定吸光值。以吸光值為縱坐標，對應的可溶性蛋白質含量（μg）為橫坐標制作標準曲線。以超純水替代標準品溶液作為空白對照，每組實驗平行3次。標準曲線方程為：y=0.0045x-0.0058，R2=0.9983。

樣品的測定：配制樣品溶液，按照制作標準曲線的操作進行樣品的測定，每組實驗平行3次，求取平均值，通過樣品溶液的吸收值，根據標準曲線回歸方程求出樣品中可溶性蛋白質的含量，按照下式計算樣品中可溶性蛋白質的含量：

式中，m為供試液中可溶性蛋白質含量（μg）；d為測定液的稀釋倍數；M為供試樣品的質量（mg）。

1.2.3紅外光譜分析準確稱取CPP 1～2mg，與干燥KBr碾碎混勻，壓成1.0mm薄片，采用傅里葉轉換紅外光譜（FT-IR）進行紅外光譜檢測，波長掃描范圍4000～500cm-1。

1.2.4抗氧化活性測定

1.2.4.1DPPH自由基清除活性的測定參照參考文獻［16］中的方法：取2m L不同質量濃度的CPP和VC樣品溶液與2m L 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，靜置30m in，517nm處測定吸光度。DPPH自由基清除能力通過以下公式計算：

式中，Ai為DPPH與樣液反應后的吸光度，Aj為樣品空白的吸光度，Ac為未加樣的DPPH吸光度，每一樣品平行測三次，取其平均值。

1.2.4.2羥基自由基清除活性的測定采用參考文獻［17］中的方法，取2mmol/L FeSO4溶液3m L，加入1mmol/L H2O2溶液3m L，再加入6mmol/L水楊酸溶液3m L，立即搖勻，37℃水浴下加熱15m in后取出，然后加入1.0m L不同質量濃度的樣品液，繼續水浴加熱15m in，冷卻至室溫在520nm下測定吸光度，VC作為對照。羥基自由基清除能力通過以下公式計算：

羥基自由基清除率（%）=（Ai-Aj）/（Ac-Aj）×100

式（5）

式中，Ai為·OH與樣液反應后的吸光度，Aj為樣品空白的吸光度，Ac為未加H2O2的吸光度，每一樣品平行測三次，取其平均值。

1.2.4.3超氧陰離子自由基清除活性的測定參考文獻［18］中的方法：用0.05mol/L、pH=7.4的PBS緩沖液為溶劑配制3.3×10-6mol/L核黃素，0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蘭（NBT），分別取上述溶液各2.0m L，加入各濃度CPP和VC溶液1.0m L，混勻光照30m in后，在560nm下測定吸光度。超氧陰離子自由基清除能力通過以下公式計算：

超氧陰離子自由基清除率（%）=（1-Ai/Aj）×100

式（6）

式中，Ai為樣液反應后的吸光度，Aj為樣品空白的吸光度，每一樣品平行測三次，取其平均值。

1.2.4.4還原力的測定采用鐵氰化鉀法參照參考文獻［19］。以VC為對照，將CPP和VC配制成不同質量濃度的樣品溶液，分別取樣品溶液2.5m L加入到2.5m L PBS（0.2mol/L，pH 6.6）中，再加入1.0m L鐵氰化鉀（1%，w/v），混勻后50℃水浴20m in。冷卻至室溫加入2.5m L三氯乙酸（10%，w/v），3000r/min離心10min。分別取2.0m L上清液加入2.0m L超純水，再加入0.5m L三氯化鐵（0.1%，w/v），室溫放置10m in后，700nm處測定光吸收值。吸光值越高表明樣品的還原力越強。

2　結果與分析

2.1CPP的化學組成

苯酚硫酸法測得CPP總糖質量分數為56.13%，硫酸咔唑法測得其中糖醛酸質量分數為8.65%，王文平法測得其蛋白質的質量分數為4.53%。說明蓬莪術多糖是含有少量蛋白的酸性糖。

2.2CPP的紅外光譜

紅外光譜是研究多糖官能團的有效手段，如圖1所示，紅外光譜檢測結果表明：CPP在3380～3400cm-1處有O-H伸縮振動的吸收峰，2929～2933cm-1處有C-H伸縮振動的吸收峰，這兩組峰是糖類的特征吸收峰。1616cm-1附近的吸收峰為C=O非對稱伸縮振動峰，1417cm-1附近的吸收峰為C=O對稱伸縮振動峰。1100～1000cm-1處的吸收峰是由C-O-C伸縮振動產生，在890cm-1左右出現吸收峰β-糖苷鍵的特征吸收峰。

圖1　CPP的紅外光譜圖Fig.1　Infrared spectra of CPP

2.3CPP的抗氧化活性

2.3.1CPP對DPPH自由基的清除作用DPPH自由基是一種比較穩定的自由基，廣泛應用于測定純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性。由圖2可以看出，在低濃度范圍內，CPP對DPPH自由基的清除率與質量濃度呈現較好的量效關系，但隨著CPP質量濃度的增加，清除率趨于平緩，質量濃度大于0.75mg/m L后，CPP的清除率基本穩定在82.33%，清除DPPH自由基50%時的CPP質量濃度即IC50為0.29mg/m L。較低的IC50值表示CPP較高的DPPH自由基清除能力。

圖2　CPP和VC對DPPH自由基的清除能力Fig.2　DPPH radical scavenging abilities of CPP and VC

圖3　CPP和VC對羥基自由基的清除能力Fig.3　Hydroxyl radical scavenging abilities of CPPand VC

2.3.2CPP對·OH的清除作用羥基自由基是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基，清除羥基自由基的能力是評價抗氧化物質的重要指標。由圖3可知CPP有很強的清除羥基自由基的作用，隨著質量濃度的增加，CPP的清除能力依次增加。在低濃度范圍內，CPP對·OH的清除率與質量濃度呈現較好的量效關系。在相同質量濃度下，小于0.5mg/m L時，CPP清除·OH的能力大于VC，但大于0.5mg/m L后，對照品VC的清除能力迅速上升，在1.0mg/m L后，VC對羥基自由基的清除率接近100%，而CPP對清除羥基自由基有明顯的濃度效應關系，當質量濃度達到1.0mg/m L時，CPP對·OH的清除率達到最大值86.13%，其IC50值為0.44mg/m L。

2.3.3CPP對·O2-的清除作用·O2-即是陰離子，又是自由基，性質活潑，具有很強的氧化性和還原性，既是氧化劑，又是還原劑，過量生成可致組織損傷。圖4表明，CPP對超氧陰離子有一定的清除作用，在低濃度范圍內，CPP對超氧陰離子清除作用一直隨濃度增加而增大。在1.0mg/m L時達到最大（83.33%），而后清除率不變，IC50值為0.36mg/m L，表明CPP具有較強的·O2-清除活性。

圖4　CPP和VC對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.4　Superoxide anion radical scavenging abilities of CPP and VC

2.3.4CPP的總還原能力抗氧化物質的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯系，還原力越強，抗氧化性越強。由圖5可知，在小于1.0mg/m L的質量濃度內，CPP的還原力隨著濃度的增加而增加；當濃度為1.0mg/m L時，吸光度為0.95；當濃度為1.25mg/m L時，吸光度為1.01。對于分光光度法而言，當吸光度高于1.0時，測量結果的相對誤差較大，故不再進一步增加CPP質量濃度。在已測量的質量濃度內，CPP的還原力不及VC，但與濃度呈正相關。

圖5　CPP和VC的還原力Fig.5　Reducing power of CPP and VC

3　結論

已有許多研究表明從藥用植物中提取的多糖具有很好的抗氧化活性。從杜仲中提取的多糖具有很強的DPPH自由基的清除能力和較強的還原能力，在相同濃度下清除能力高于維生素C［20］。從魚腥草中提取的多糖具有較好的DPPH自由基，羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除活性［21］。通過本文實驗結果可以發現，從藥用植物蓬莪術中提取的多糖是含有少量蛋白的酸性糖，具有糖類典型的紅外吸收峰，含有β糖苷鍵。體外抗氧化實驗表明，CPP對DPPH自由基、·OH和·O2-都具有一定清除能力以及較強的還原能力，隨著質量濃度的提高，清除效果越明顯，清除DPPH、·OH、·O2-自由基的IC50值分別為0.29、0.44、0.36mg/m L。蓬莪術多糖具有明顯的抗氧化能力，可以開發成為高效、低毒的天然抗氧化劑應用于食品及保健領域，而有關蓬莪術多糖的結構鑒定及抗氧化活性機理有待進一步研究。

［1］張雅君，梁忠巖，張麗霞.黨參粗多糖的組成及其免疫活性研究［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2012，40（7）：199-202.

［2］姜琛璐，湯承，騫宇，等.黃芪多糖免疫調節作用研究進展［J］.食品科學，2013，34（11）：327-332.

［3］Xiang DB，LiXY.Antitumoractivity and immuno-potentiating actionsofAchyranthesbidentatapolysaccharides［J］.Acta Pharmacologica Sinica，1993，14（6）：556-561.

［4］王春花，金秧敏，張燕華，等.8種中藥多糖及其硫酸化衍生物對新城疫病毒的影響［J］.中國獸醫雜志，2012，48（8）：42-45.

［5］Sun Y L，Tang J，Gu X H，etal.Water-soluble polysaccharides from Angelica sinensis（Oliv.）Diels：Preparation，characterization andbioactivity［J］.InternationalJournalofBiological Macromologcal，2005，36（5）：283-289.

［6］Wu Y，Ou-Yang J P，Wu K，et al.Hypoglycemic effect of Astragalus polysaccharide and its effect on PTP1B1［J］.Acta Pharmacological Sinica，2005，26（3）：345-352.

［7］Leung M Y K，Liu C，Koon JC M，et al.Polysaccharide biological response modifiers［J］.Immunology Letters，2006，105（2）：101-114.

［8］萬德光，彭成，衛瑩芳，等.四川道地中藥材志［M］.成都：四川科學技術出版社，2005：449-452.

［9］Institute of materia medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Modern studies on chinese traditional medicines［M］. Beijing：Peking Union Medical college and Beijing Medical Univers ity United Press，1996：87-90.

［10］Rasmussen H B，Christensen SB，Kvist L P，et al.A Simple and Efficient Separation of the Curcumins，the Antiprotozoal Constituents of Curcuma longa［J］.Planta Medica，2000，66（4）：396-398.

［11］Zeng JH，Xu GB，Chen X.Application of the chromatographic fingerprint for quality control of essential oil fromGuangXi Curcuma kwangsiensis［J］.Medicinal Chemistry Research，2009，18（2）：158-165.

［12］DuBois M，Gilles K A，Hamilton JK，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［13］Cuesta G，Suarez N，Bessio M I，et al.Quantitative determination of pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14 using amodification of phenol-sulfuric acidmethod［J］.JournalofMicrobiologicalMethods，2003，52（1）：69-73.

［14］夏永剛，梁軍，楊柄友，等.麻黃多糖中糖醛酸含量的測定［J］.中醫藥學報，2011，39（1）：71-73.

［15］王文平，郭祀遠，李琳，等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量［J］.食品研究與開發，2008，29（1）：115-117.

［16］鄭大貴，葉青，葉紅德，等.DPPH·法評價VC、異VC及其衍生物的抗氧化性能［J］.食品工業科技，2012，33（8）：380-383.

［17］陳莉華，廖微，肖斌，等.玄參多糖體外清除自由基和抗氧化作用的研究［J］.食品工業科技，2013，34（7）：86-89.

［18］Beauchamp C，Fridovich I.Superoxide dismutase：improved assays and an assay applicable to acrylamidegels［J］.Analytical Biochemistry，1971，44（1）：276-287.

［19］竇嬌，郭玉蓉，薛戰鋒，等.榨前分離蘋果皮多糖的鑒定及其抗氧化活性研究［J］.食品工業科技，2014，35（1）：111-115.

［20］孫曦曉，劉再枝，杜新琦，等.超聲輔助提取杜仲多糖及其抗氧化活性［J］.植物研究，2014，34（3）：428-432.

［21］Tian LM，Zhao Y，Guo C，et al.A comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived fromherbal Houttuynia cordata［J］. Carbohydrate Polymers，2011，83（2）：537-544.

Antioxidant activities of polysaccharides from rhizomes of the herb Curcuma phaeocaulis in vitro

GOU Xue-mei1，WANG Qian1，GAO Gang1，ZHOU Yong-hong2，YANG Rui-wu1，*
（1.College of life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Triticeae Research Institute，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China）

Water-solub le polysaccharides were obtained from rhizomes on roots of the herb Curcuma phaeocaulis Valeton.In add ition，the total contents of carbohyd rate，uronic acid and p rotein of C.phaeocaulis polysaccharide were measured by chem icalmethods，and the structural characteristic of CPP was detected by FT-IR spectra. Furthermore，the antioxidantactivities of CPPwere evaluated on the basis of DPPH，hyd roxyl radical，superoxide anion rad icals scavenging ability and reducing power in vitro.The results showed that the contents of carbohyd rate，uronic acid and p rotein were 56.13%，8.65%and 4.53%，respectively.The results showed that the CPP possessing remarkab le free rad ical scavenging activity and a good reducing power in vitro antioxidant assay.The IC50values of scavenging free radicals were 0.29，0.44，0.36mg/m L，respectively.

Curcuma phaeocaulis Valeton；polysaccharides；antioxidantactivity

TS201.2

A

1002-0306（2015）06-0122-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.019

2014-07-03

茍學梅（1990-），女，碩士研究生，研究方向：植物化學與成分分析。

楊瑞武（1969-），男，博士，教授，主要從事植物系統與進化方面的研究。

國家自然科學基金（31270243）。