產酸優勢醋酸菌的分離及其增殖產酸與乙醇的灰色關聯分析

葉日英，伍　彬，陳海燕

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

產酸優勢醋酸菌的分離及其增殖產酸與乙醇的灰色關聯分析

葉日英，伍彬，陳海燕

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

為了從自然界中分離得到產酸能力較強的醋酸菌，并明確發酵基質中乙醇濃度對醋酸菌細胞增殖和產酸量的相關關系。實驗以腐爛的菠蘿果實為原料進行醋酸菌分離純化，選取溶鈣圈較大的菌落進行發酵產酸對比實驗，經過對發酵液含酸量的測定，找出產酸量最大的菌株，然后將目標菌分別接種到不同乙醇濃度的發酵液進行恒溫發酵，經過一定時間后檢測各個發酵液的醋酸菌細胞總量和產酸量，所得數據用灰色關聯分析法處理，通過計算獲得醋酸菌細胞增殖和產酸量與乙醇濃度的關聯度，并比較兩者的關聯序。實驗結果獲得一株產酸能力相對較強的醋酸菌S1，發酵液乙醇濃度與S1產酸量和細胞增殖的關聯度分別是0.655、0.517。結果表明：乙醇對S1產酸量關聯顯著（關聯度＞0.6），而對S1細胞增殖關聯不顯著（關聯度＜0.6），乙醇對醋酸菌產酸的影響效果大于對其細胞增殖的影響。

醋酸菌，細胞增殖，產酸量，乙醇，灰色關聯分析

醋酸菌是專性好氧細菌，能把乙醇氧化為醋酸，是食品工業上用于發酵生產醋酸的菌種。由于醋酸對人體具有重要的保鍵作用，如預防高血壓、高血脂、脂肪肝和糖尿病［1］等等，所以醋酸一直受到人們的重視。很早以前人們主要把醋作為調味品食用，隨著生活水平的提高，人們對醋的需求不再滿足于純粹的調味作用，更多地追求醋酸新產品，現在已經實現了大規模開發和生產醋酸飲料，其中最大宗的是水果發酵醋飲料如蘋果醋飲料、紅棗醋飲料和菠蘿醋飲料等等，據不完全統計，目前我國食醋的年產量約為200～250萬噸［2］。由于食醋是由醋酸菌發酵產生的，所以醋酸菌是生產食醋最關鍵的條件，目前我國用于食醋生產的醋酸菌主要是中科1.41及滬釀1.01菌株，均為醋酸桿菌屬細菌。為了追求產醋酸能力較大、產醋酸口感質量更好的醋酸菌種，研究人員一直致力于探索和研究新的醋酸菌種［3-8］。醋酸菌在自然界的分布很廣泛，在未滅菌的醋、啤酒、黃酒、果酒以及成熟或腐敗的水果中都有醋酸菌生長［9-10］。為了得到口感質量較好，醋酸產量較大的醋酸發酵技術，研究人員從發酵溫度、初始pH、發酵時間和基質成分等方面進行了許多研究［11］，相關的研究報道證明，發酵基質的乙醇濃度對醋酸菌的發酵產酸影響較大［12-13］，但對乙醇影響醋酸菌發酵的機理過程的目前未見有研究報道。因為醋酸菌發酵過程主要是不斷地進行細胞增殖和產酸的過程，據此本項目實驗用腐爛的菠蘿果實分離醋酸菌，通過產酸對比實驗尋找產酸能力相對較強的菌株，然后進一步對分離得到的菌株作不同乙醇濃度的培養發酵實驗，檢測醋酸菌在不同乙醇濃度中細胞的增殖量和產酸量，所得實驗數據用灰色關聯分析法（Grey Relational Analysis）處理［14］，通過計算細胞增殖量和產酸量與乙醇濃度的關聯度和關聯序，從而確定乙醇對醋酸菌細胞增殖和產酸量影響效果的大小。

灰色關聯理論是通過一定的方法，尋求在一個系統發展中幾個因素之間的數值變化關系，其意義是指在系統發展過程中，如果兩個因素的同步變化程度越高，則其關聯度就越大，反之關聯度越小，灰色關聯分析法可以為一個系統中幾個因素的發展態勢作出量化的比較。灰色關聯分析法是進行科研實驗數據處理和分析的較好方法，得到廣大科研工作者的喜愛和應用，已經廣泛應用于社會科學、微生物學和毒理學研究的數據統計分析［14-15］。由于醋酸菌的發酵過程是不斷地進行細胞增殖和產酸的過程，因此，利用灰色關聯分析法計算乙醇濃度分別與醋酸菌的細胞增殖和產酸量的灰色關聯度，得到乙醇分別對醋酸菌的細胞增殖和產酸量影響程度的量化比較，就能明確乙醇對醋酸菌發酵效果影響的關鍵原因。

1　材料與方法

1.1材料與設備

腐爛菠蘿取自湛江市徐聞菠蘿種植園；分離用培養基葡萄糖1%、酵母膏1%、無水乙醇3%、瓊脂2%、CaCO32%，自然pH；液態基礎培養基葡萄糖1%、酵母膏1%、無水乙醇6%，pH 5.5；上述的試劑均購買于北京陸橋技術責任有限公司，為化學純。

SW-CJ-2F型超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩培養箱金壇市萬華實驗儀器廠；L1100A型生物顯微鏡廣州粵顯光學儀器有限責任公司；2-16K型離心機Sigma公司；GZX-9140MBE型立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實業有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1增菌培養及醋酸菌的分離取10g腐爛菠蘿搗碎后加入盛有100m L液態基礎培養基的三角瓶中，置于32℃恒溫振蕩培養箱中增殖培養3d后，吸取1m L加入裝有9m L的無菌生理鹽水的試管中，制成濃度梯度為10-1的菌懸液，然后逐步稀釋至10-5、10-6、10-7濃度梯度，吸取后三個濃度梯度的稀釋液各0.2m L，用傾注法接種于分離培養基，每個梯度2個平板，32℃恒溫培養2～3d后觀察。根據醋酸菌在分離培養基上是否產生溶鈣圈初步定性［14］，若產生溶鈣圈，則初步定為醋酸菌；從不同的稀釋度的平板中挑取溶鈣圈較大、長勢良好的單菌落進行純化［16-17］。

1.2.2產醋酸定性實驗根據醋酸菌培養液與FeCl3溶液反應進行醋酸定性實驗［17］。取活化好的斜面菌種一環，分別接種于100m L基礎液態培養基中，30℃恒溫培養箱靜置淺層培養72h。利用離心機除去菌體，取5m L除去菌體的培養液于小燒杯中，用0.1mol/L NaOH溶液中和至中性，然后加入5～6滴5.0%的三氯化鐵溶液，若形成紅褐色沉淀則此菌株可鑒定為醋酸菌［19］。

1.2.3產酸優勢菌株的確定將初篩得到的菌株接種于液態基礎發酵培養基中，每株菌平行3組，于32℃恒溫培養箱中培養4d后，利用醋酸定量測定法測定發酵液中的醋酸含量：精確吸取發酵液2m L至250m L三角瓶中，并加入蒸餾水50m L，滴加3～5滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已標定過的0.1mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。由消耗的NaOH溶液的體積計算樣品中的含酸量（以醋酸計），確定產酸量大的醋酸菌［20-21］。

產酸量（g/L）=（V-V0）×CNaOH×60/L

式中：V—為發酵液樣品滴定消耗的NaOH溶液的體積m L；V0—以空白培養基為對照滴定消耗的NaOH溶液的體積m L；CNaOH—NaOH溶液的濃度（mol/L）；L—樣品體積；60—為醋酸分子量。

1.2.4乙醇濃度對醋酸菌細胞增殖和產酸的影響選取產酸優勢菌株進行不同乙醇濃度發酵實驗：取醋酸菌3環，接入20m L生理鹽水（20m L/250m L三角瓶）中充分振蕩搖勻，以2%接種量接種于基礎液態培養基32℃培養48h，然后將種子液以5%的接種量分別接種于具有不同酒精濃度的100m L液態培養基的三角瓶中，其中的酒精度分別為3%vol、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol，于32℃振蕩培養箱中發酵培養6d后，將發酵液離心（10000r/m in，15m in）沉淀，把醋酸菌細胞和發酵液分離，取上清液測定含酸量，并稱取沉淀出來濕菌體重量，每個乙醇濃度2個平行，考察酒精濃度對醋酸菌生長和產酸的影響。

1.2.5數據處理分析法將不同乙醇濃度發酵液所測得的醋酸菌細胞增殖和產酸量數據，根據灰色關聯分析法原理，分別進行灰色關聯分析計算。

2　結果與討論

2.1分離得到的醋酸菌菌落和細胞形態

經過平板分離培養48h得到菌落如圖1所示，菌落的顏色白色或略帶微黃，半透明或不透明，個體非常小，表面光滑濕潤，所產的醋酸使碳酸鈣溶解形成明顯的透明圈。將菌落作平板劃線純化分離培養后得到三株菌，分別命名為S1、S2、S3，菌落特征如圖2所示，從劃線培養的菌落可以看到醋酸菌產生的醋酸使平皿底部的碳酸鈣溶解形成明顯的透明區域；將三株菌鏡檢，觀察到S1和S2細胞都是明顯的桿狀形，S1細胞呈鏈狀排列，較粗大，S2呈對狀排列，桿狀較細小，S3細胞呈橢圓形（圖3），用三株菌的發酵液作醋酸定性鑒定實驗結果都有紅褐色現象，確認所得到三株菌都產醋酸［22］。

圖1　腐爛菠蘿中分離的醋酸菌菌落Fig.1　The separated acetic bacteria colony of rot pineapple

圖2　3株菌劃線培養的醋酸菌菌落Fig.2　Three strains of acetic bacterias colony with lineation inoculate

圖3　三株醋酸菌的鏡檢細胞形態圖Fig.3　The cellularmorphologymicroscopic of three strains acetic bacterias

2.2醋酸菌產酸優勢菌株確定

將分離得到的3株醋酸菌用液態基礎培養基進行產酸實驗，通過發酵液的醋酸含量檢測，結果S1、S2、S3菌株的產酸量分別是22.23、8.15、13.70g/L，S1菌產酸量較大，因此選擇S1菌進行乙醇濃度影響實驗［23］。

2.3乙醇濃度對S1菌細胞繁殖和產酸量的影響

選取31℃為發酵溫度，將基礎發酵液改變乙醇濃度時S1菌發酵6d細胞生長總量及產酸量分別如表1所示。

表1　不同酒精濃度下S1發酵液的細胞濕重及產酸量Table 1　The cellwetweightand acid yield of S1 fermentationbroth on differentalcohol concentration

表1的結果說明S1菌耐酒精能力達到為9%（V/V），高于這個濃度時細胞生長繁殖受到抑制，同時產酸量也減少。酒精濃度為9%（V/V）時可獲得最高的產酸量36.27g/L。

2.4乙醇濃度與S1菌細胞繁殖和產酸量的灰色關聯分析

按照灰色關聯分析理論，將醋酸菌的細胞增殖和產酸量與乙醇濃度、建立動態模型，動態分析的建模方法［15］如下：

以乙醇濃度為參考數列，產酸量和細胞濕重為比較數列，建立原始數列，參考數列記作（y0代表乙醇濃度參考數列；k是實驗組別，k=1，2，3，…6）；比較數列記作（yi代表產酸量和細胞濕重兩個比較數列，i= 1，2）按下列公式將原始數列的數據進行無量綱化處理，以消除數量單位和級別不同所帶來的影響，得到式（1），公式中的和Si分別表示平均值和標準差。

計算每個時刻點的參考數列與比較數列差的絕對值，并找出最大的和最小的差絕對值，得到差的絕對值序列，記作△i（k）最大差△max=；最小差△min=mix

計算相關系數按式（2）計算，關聯系數的意義是指在某個時刻子因素與母因素的相對差值，ρ是分辯系數，取值在0～1之間，通常取0.5。

計算灰色關聯度：根據相關系數，按公式（3）利用算術平均法計算出灰色關聯度，關聯度越接近1，說明兩因素關聯度越大，當ρ=0.5時，關聯度≥0.6，就表示關聯性顯著［24］。利用灰色關聯分析模型，根據表1的數據，經過數值無量綱化法處理后得到數值如表2所示。

表2　不同乙醇濃度的細胞濕重及產酸量無量綱化表Table 2　The cellwetweightand acid yield on differentalcohol concentration with dimensionlessmethod

表3　乙醇濃度與細胞濕重和酸含量的關聯數值表Table 3　The relevance between alcohol concentration and cellwetweightand acid yield

根據無量綱化表數據，用matlab編程計算得到關聯系數和關聯度如表3所示。

由表3中乙醇濃度影響醋酸菌細胞增殖和產酸量的灰色關聯計算結果看出，發酵液乙醇濃度對細胞增殖的關聯度為0.517（＜0.6），說明關聯不顯著，而對產酸量的關聯度為0.655（＞0.6），說明關聯顯著。這個結果說明乙醇對醋酸菌產酸量的作用效應大于對細胞增殖作用效應。

3　結論

從腐爛菠蘿中分離篩選得到一株產酸能力較強醋酸菌S1，S1在基礎液態培養基中發酵能達到22.23g/L，耐乙醇濃度最高達9%（vol）；發酵基質的乙醇濃度與醋酸菌細胞增殖關聯不顯著，而與醋酸菌產酸量關聯顯著，因此，發酵基質的乙醇濃度對醋酸菌產酸量影響程度較大，對醋酸菌細胞增殖的影響作用較小。

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The separation of acetic bacteria advantage lies in acid production and the grey relationalanalysis on its proliferation and acid production w ith ethylalcohol

YE Ri-ying，WU Bin，CHEN Hai-yan
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

In order to get acetic bacterial strain which had advantage lays in acid p roduction from nature，c lear and definite the relationship between its acid p roduction，cell p roliferation and ethanol concentration of fermentation substrate.In the experiment acetic bac teria was separation and purification w ith rotten pineapp le，the bacterial colony which had bigger solub le calcium circ le was selected and put into fermentation for acid p roduction.Then the strain which had the highest acid p rodution was found out after determ ined acid content of fermentation b roth.It was put into the fermentation experiment on constant tem perature w ith a series of alcohol concentration.After a time the cell p roliferation and acid p roduction were detec ted.Datas of these was put into analysis based on the g rey relational analysis，by calculation two relevancies between alcohol concentration and acid p roduction and cell p roliferation were acquired.And their relational sequence was put into compare.As the result，a acetic bacterial strain S1 which had advantage lies in acid p roduction was got out，the relationaldegree between acid p roduction，cellp roliferation of S1 and alcohol concentration respectively was 0.670 and 0.517.The results showed that the correlation was outstanding between acid p roduction of S1 and alcohol concentration（relational degree＞0.6），and the correlation was non-significant between cell p roliferation and alcohol concentration（relational deg ree＜0.6）.The effect of ethyl alcohol for acid p roduction was greater than that for cellp roliferation.

acetic bacteria；cellp roliferation；acid p roduction；ethylalcohol；the g rey relationalanalysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.028

2014-05-08

葉日英（1965-），女，本科，研究方向：食品科學與工程。

廣東省科技廳農業攻關項目（2010B020313004）；廣東省湛江市科技局科技攻關項目（2012C3104001）。