小麥蛋白酶解制備多肽過程中褐變的抑制

戚春江，孫　超，谷中華，田啟梅，馬葉勝

（安徽瑞福祥食品有限公司，安徽亳州236800）

小麥蛋白酶解制備多肽過程中褐變的抑制

戚春江，孫超*，谷中華，田啟梅，馬葉勝

（安徽瑞福祥食品有限公司，安徽亳州236800）

為了抑制小麥蛋白在酶解制備小麥多肽過程中大量色素物質的生成，通過添加檸檬酸、L-半胱氨酸、葡萄糖氧化酶等抑制劑研究褐變抑制的規律，并通過單因素實驗和Box-Behnken實驗對褐變抑制工藝進行優化。結果表明，對褐變抑制率影響大小順序依次為檸檬酸、L-半胱氨酸、葡萄糖氧化酶，且三者對褐變抑制率都呈顯著影響（p＜0.05）。響應面實驗獲得的優化工藝條件為：葡萄糖氧化酶0.02%、L-半胱氨酸0.75%、檸檬酸0.16%，在此條件下褐變抑制率可達44.35%。在本實驗范圍內建立的二次線性回歸模型擬合較好，在一定條件下抑制劑能有效抑制褐變在小麥蛋白酶解過程中的發生，減少色素物質的生成，且不影響小麥蛋白的降解率。

小麥蛋白，酶解，抑制劑，褐變抑制

小麥蛋白是從小麥加工中得到的一種優質蛋白質，其蛋白質含量約為80%，具有極佳的延伸性、吸水性、薄膜成形等特性，但是，由于小麥蛋白的分子量較大，在水中的溶解性很差［1-3］，嚴重影響了小麥蛋白在生產中的應用。近年來，國內相關企業通過酶法水解小麥蛋白來提高其營養保健價值及加工功能特性。小麥蛋白多肽不僅具有很好的溶解性、乳化性、起泡性及良好的流動性，而且在體內吸收快、利用率高。小麥蛋白經酶解生成的分子量較小的肽后還具有抑制血壓、降低膽固醇、提高機體免疫力等生物活性作用。

但是植物蛋白酶解轉化為多肽的過程中會伴隨著大量色素物質的生成，造成得到的多肽混合物呈現出烏褐色乃至黑褐色，從而影響市場競爭力，因此在保證產品質量的前提下制備過程中必須抑制色素物質的生成［4］。目前，國內外的脫色方法多為采用活性炭粉末、硅藻土等吸附劑進行吸附脫色，雖然效果較為理想，但都是在色素物質生成以后再進行脫除，不僅增加了設備投資，且蛋白酶解液中多肽損失率較高，造成生產成本的增加，營養功能的降低［5］。根據近代波譜理論，有機物的顏色是由含共軛雙鍵系統的生色團、發色團引起的，使用還原劑可與共軛雙鍵形成加成物，使用氧化劑可有效破壞共軛雙鍵體系，使用含硫親核化合物可捕獲自由基抑制類黑精的產生［6］。

由于氧化劑會破壞小麥多肽中的抗氧化成分［7］，因此針對小麥蛋白酶解過程中的褐變原因，在生產過程中最大限度的抑制色素生成，本文研究了非氧化型抑制劑葡萄糖氧化酶（GOD）、L-半胱氨酸、檸檬酸的添加來抑制褐變的形成［8-11］，以期對產業化利用抑制劑抑制褐變具有一定的指導和應用價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

中性蛋白酶0.8L（EC 3.4.23.6，9.62×105U/g）、堿性蛋白酶2.4L（EC 3.4.21.62，4.3×105U/g） 丹麥NOVO公司；木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2，9.8×104U/g）AB酶制劑公司；小麥蛋白（蛋白含量81%，濕基） 安徽瑞福祥食品有限公司；L-半胱氨酸（食品級） 國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4，3.52×104U/g）諾維信酶制劑公司；檸檬酸國藥集團化學試劑有限公司；其他所用試劑均為國產分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；PHS-2C型酸度計上海雷磁儀器廠；TG16-WS型高速離心機長沙平凡儀器儀表有限公司；PL303型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CU-420電熱恒溫水浴上海齊欣科學儀器有限公司；HJ-2A型磁力攪拌器江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1小麥多肽的制備參考谷中華等［12］的實驗方法，并稍作改變。將小麥蛋白按3∶10（m/v）的比例混勻在水溶液中，均質后配制成質量濃度300g/L的懸浮液，調節至合適的pH與溫度后加入一定比例抑制劑，在溫度50℃的條件下，先用堿性蛋白酶在pH為8.5的條件下酶解1h，然后調節酶解溶液的pH至中性條件下用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解3h。待酶解反應結束后，在沸水浴中滅酶10m in，制得小麥蛋白的多肽酶解物。待上述酶解物冷卻至室溫條件下，酶解液經噴霧干燥后即得固體小麥多肽。

1.2.2小麥多肽降解率準確稱取5g固體小麥多肽樣品溶于250m L蒸餾水中，1500r/m in離心10m in。收集上清液并采用微量半自動凱氏定氮儀測定其蛋白質含量，以此計算小麥多肽的降解率（HR）。

HR（%）=（上清液蛋白含量/小麥蛋白蛋白含量）×100

1.2.3小麥多肽酶解液色素抑制率計算參照劉慧賓等［13］的實驗方法，取上述蛋白酶解上清液用紫外可見分光光度計在色素的最大光譜吸收處（波長400nm）測其吸光度值。由測得的吸光度計算蛋白酶解液的色素抑制率，計算公式為：

色素抑制率（%）=（A-B）/A×100

式中：A—未經抑制色變的酶解液吸光度；B—抑制色變的酶解液吸光度。

1.3多肽降解率與色素抑制率的單因素實驗

分別稱取一定濃度梯度的非氧化性抑制劑，加入到各自的酶解溶液中，待酶解反應結束后，測定酶解物中多肽的降解率與色素的抑制率，以此確定較優的抑制劑的添加量。

1.4響應面實驗設計

運用Box-Behnken實驗設計方法對小麥蛋白酶解液褐變抑制效果進行響應面優化研究。以褐變抑制率為響應值（Y），建立模型方程并分析各設定因素及其交互作用的顯著性，以此預測最佳的抑制褐變的各種因素水平組合，并以實驗驗證該組合是否最優。

按照Box-Behnken響應面實驗設計原理，結合前述的研究結果，將葡萄糖氧化酶、L-半胱氨酸、檸檬酸這三個影響因素設計為三因素三水平的響應面法實驗，具體響應面法實驗的因素與水平值見表1。

表1　響應面實驗因素與水平Table 4　Independent variables and their levels used in the response surface design

1.5數據處理

運用Design Expert 7.0軟件對數據進行回歸分析得到二次多項回歸方程模型，其他數據采用SPASS 17.0進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗（p＜0.05），數據以平均值±標準偏差的形式表示。

2　結果與討論

2.1葡萄糖氧化酶對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響

表2　葡萄糖氧化酶對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響Table 2　Effectof GOD on color formation of hydrolysis of wheat protein

由表2可知，隨著葡萄糖氧化酶添加量的增加，酶解液中小麥蛋白多肽的降解率沒有顯著的變化，但是酶解液的色素抑制率增加的較為顯著（p＜0.05），當葡萄糖氧化酶添加量為0.03%時，酶解液中色素抑制率達到最高水平，再進一步增加其添加量時，色素抑制率沒有顯著性的變化，因此在多肽酶解物制備的過程中，葡萄糖氧化酶的添加量為0.03%是一個較為優化的水平。葡萄糖氧化酶對蛋白酶解效率有一定的抑制作用，這主要是因為葡萄糖氧化酶在催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫時，過氧化氫將面筋蛋白分子中巰基氧化為二硫鍵，增強了面筋的網絡結構［14-17］，不利于酶解的進行，從而可以減緩美拉德反應，所以對色素有一定的抑制作用。

2.2L-半胱氨酸對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響

表3　L-半胱氨酸對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響Table 3　Effectof L-Cysteine on color formation of hydrolysis of wheat protein

如表3所示，L-半胱氨酸添加量在0%～1.4%內，隨著添加量的增加，酶解液中小麥蛋白多肽的降解率變化顯著，但呈現逐漸上升的趨勢，而酶解液的色素抑制率呈現出顯著性的增加趨勢，當L-半胱氨酸的添加量為0.8%時，酶解物中色素的抑制率達到較為優化的水平，再進一步增加其添加量時，色素抑制率的變化幅度很小，因此在多肽酶解物制備的過程中，L-半胱氨酸的添加量為0.8%是一個較為優化的水平。由于L-半胱氨酸是一種脂肪族的含巰基的極性α-氨基酸，具有較強的還原性，能夠與多酚氧化酶氧化成的醌類物質加成，生成無色穩定的L-半胱氨酸衍生物，還能將體系中的醌類及其衍生物還原成酚類，并通過自身氧化降低體系中的含氧量，從而到達抑制褐變的目的。同時L-半胱氨酸還能夠通過改變小麥蛋白分子間或分子內的二硫鍵，減弱蛋白質結構的緊密性，使得蛋白質伸展開來，進而使得小麥蛋白內部原本隱藏的酶切位點暴露出來，加速了酶制劑的酶解進程［18］，所以，L-半胱氨酸添加量在0～1.4%內，隨著添加量的增加，降解率也有升高的趨勢。

最新研究表明L-半胱氨酸抑制因美拉德反應引起的色澤變化的原理是作用于氨基化合物和還原糖縮合重排形成的Amadori產物，干擾肽和糖的Amadori形成，進而有效地阻止Amadori化合物的進一步生成脫氧還原酮以及環化，抑制呈色物質的生成，實現了色澤形成的抑制作用［10］。

2.3檸檬酸對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響

表4　檸檬酸對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響Table 4　Effectof citric acid on color formation of hydrolysis of wheat protein

隨著檸檬酸添加量的增加，小麥蛋白多肽降解率呈現先增加后下降的趨勢，因為適量的檸檬酸能夠對小麥蛋白進行脫酰胺改性，使得酰胺基團中氨基變成高親水的羧基，減少蛋白質分子內氫鍵的作用，增大分子間靜電排斥，改善小麥蛋白溶解性，暴露出更多的酶切位點，從而提高了降解率［19］，但是當檸檬酸添加量超過一定范圍時，反應體系pH不再適合于酶解反應，降解率就會出現一定程度的下降。抑制褐變的效果隨檸檬酸濃度的增加而增加，當檸檬酸的添加量為0.2%時，酶解物中色素的抑制率達到較為優化的水平，再進一步增加其添加量時，色素抑制率的變化幅度很小，這是因為檸檬酸降低了反應體系的pH，并螯合多酚氧化酶活性集團中的金屬離子，降低多酚氧化酶活性，抑制酶促褐變及非酶促褐變［20］，因此在多肽酶解物制備的過程中，檸檬酸的添加量為0.2%是一個較為優化的水平。

2.4復合抑制劑對小麥蛋白酶解液色澤變化的影響

對實驗數據進行回歸分析，得到褐變抑制率（Y）對自變量A（葡萄糖氧化酶）、B（L-半胱氨酸）、C（檸檬酸）的二次多項回歸方程模型：Y=41.80+2.48A+ 2.58B+8.17C+0.87AB+0.61AC-0.36BC-1.78A2-1.29B2-2.92C2。實驗結果的回歸模型方程系數、方差分析，以及各因素的顯著性檢驗的結果見表5、表6。

由表6結果可知，回歸模型具有高度的顯著性（p＜0.01），說明實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性。此外還可以明顯看出A、B、C、C2有極顯著影響（p＜0.01），而F失擬=6.24，失擬項p=0.0546＞0.05，表明失擬不顯著。由此可以得出，該模型能夠較好的描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳的分離純化工藝條件。該回歸模型的調整確定系數為R2=0.9736，即該模型能解釋97.36%響應值的變化，表明此模型對實驗的擬合度較好，可用于指導抑制劑抑制褐變結果的分析和預測。

根據響應面實驗設計原理及分析［21］，結合圖1形狀及表6結果分析，葡萄糖氧化酶、L-半胱氨酸、檸檬酸對褐變抑制率都呈顯著影響，各因素對褐變抑制率的影響依次為：檸檬酸＞L-半胱氨酸＞葡萄糖氧化酶。同時，實驗中所設置的3個因素各水平之間交互作用對褐變抑制率的影響不顯著。

表5　實驗設計與結果Table 5　The experimental design and results for response surface analysis

表6　實驗結果的方差分析Table 6　Analysis of variance for the experimental results of response surface design

由圖1可以看出，三種抑制劑的添加都能使得小麥蛋白多肽酶解液中色素的抑制率提高，對回歸方程求一階偏導，令其等于零，求解得各因素的最佳水平值，經過數據轉換后得到抑制褐變的最佳條件為葡萄糖氧化酶添加量為0.02%、L-半胱氨酸0.75%、檸檬酸0.16%，在此條件下該工藝條件褐變抑制率的理論值為44.59%。在此條件下，進行三次平行實驗，得到褐變抑制率的平均值為44.35%，與理論預測值的誤差僅為0.54%，說明采用響應面法得到的優化結果可靠。

圖1　兩因素交互作用對抑制率影響的響應面圖Fig.1　Response surface contour plots showing the interactive effectof three extraction conditions on the yield of inhibition rate

3　結論

通過單因素實驗和Box-Behnken實驗對小麥蛋白酶解制備多肽過程中褐變抑制工藝進行優化。實驗結果表明所選擇各因素對褐變抑制率影響大小順序為：檸檬酸＞L-半胱氨酸＞葡萄糖氧化酶，且葡萄糖氧化酶、L-半胱氨酸、檸檬酸對褐變抑制率都具有顯著影響（p＜0.05）。通過響應面實驗獲得的優化工藝條件為：葡萄糖氧化酶添加量為0.02%、L-半胱氨酸0.75%、檸檬酸0.16%，在此條件下褐變抑制率可達44.35%。在本實驗范圍內建立的二次線性回歸模型準確有效，對實驗擬合較好，對產業化利用抑制劑抑制褐變具有一定的指導和應用價值。

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Browning inhibition in polypeptides produced from the hydrolysis of wheat protein by proteases

QIChun-jiang，SUN Chao*，GU Zhong-hua，TIAN Qi-mei，MA Ye-sheng
（AnhuiRuifuxiang Food Co.，Ltd.，Bozhou 236800，China）

In order to inhibit p igment substance in the p rocess of p reparation of wheat g luten polypep tides，the law of inhibiting browning stain was studied by experiment of add ing d ifferent b rowning inhibitors.Itwas found thatb rowning inhibitors could effec tively control the b rown stain in hyd rolysis ofwheat p rotein and decrease the color value under the certain cond itions.The results showed that the fac tors affec ting the inhibiting browning rate of citric acid，L-cysteine，g lucose oxidase were offered in turn，and the three browning inhibitors had significant influences on b rowning stain（p＜0.05）.The op timal p rocess conditions were obtained by Box-Behnken design as follows：0.02%g lucose oxidase，L-cysteine 0.75%，citric acid 0.16%，under the cond ition of theoreticalbrowning inhibition rate was up to 44.35%.Themodelof the two linear regressions was good based on the range of the experiment，the inhibitors could inhibit b rowning in wheat p rotein enzymolysis p rocess under the certain of cond itions，reduce the formation of pigmentmaterials，and d id not influence the deg radation rate ofwheat p rotein.

wheat p rotein；enzymolysis；b rowning inhibitors；b rowning inhibition

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.030

2014-04-28

戚春江（1969-），男，本科，研究方向：食品工程。

孫超（1987-），男，碩士研究生，研究方向：生物工程。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2013AA102201）。