基于神經網絡平臺的牡蠣肉超高壓殺菌工藝條件優化

王曉謙，鐘賽義，秦小明，鄭惠娜，章超樺

（廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

基于神經網絡平臺的牡蠣肉超高壓殺菌工藝條件優化

王曉謙，鐘賽義，秦小明*，鄭惠娜，章超樺

（廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

為研究超高壓對牡蠣殺菌的影響，利用Box-Behnken實驗設計建立數據集，以菌落總數為參考指標，借助JMP7.0軟件的神經網絡平臺建立神經網絡模型，優化牡蠣肉超高壓殺菌處理工藝條件。實驗結果表明，牡蠣肉超高壓殺菌的最佳工藝條件為壓力350MPa，保壓時間20min，處理溫度30℃，在此條件下超高壓處理后的牡蠣肉菌落總數從3.2718lg cfu/g減少到2.44342lg cfu/g（滅菌率85.13%），大腸菌群從7MPN/100g減少至0。驗證實驗結果表明，所建立的神經網絡模型具有較好的預測能力，可準確地預測殺菌效果，預測值與實驗值的相對誤差較小（0.201%）。

牡蠣，超高壓，殺菌，神經網絡

牡蠣又稱蠔、海蠣子，其營養豐富，必需氨基酸種類齊全，同時含有豐富的糖原和牛磺酸，素有“海洋牛奶”的美稱。牡蠣屬濾食性雙殼動物，在濾食藻類的同時，也會把水中的細菌及有害物質吸入至體內。近年來由于海洋環境不斷惡化，污染日益加重，食用牡蠣造成的食源性疾病的報道也越來越多。大量微生物的存在直接影響牡蠣的食用安全性，同時縮短了牡蠣保鮮期［1-2］。傳統的熱加工方法在殺菌的同時，不僅造成了牡蠣的感官品質的下降（口感粗糙，失水等），同時也造成了營養物質的流失。

超高壓技術是一種將食品原料包裝后密封于超高壓容器中，以水或其他流體介質作為壓力傳遞媒介物，在100～1000MPa的靜高壓和適當溫度下加工一定時間，達到食品滅菌、保藏和加工目的的新型食品加工技術［3］。超高壓加工食品有很多優點：它是純物理過程，能夠最大程度地保持食品的原有成分，并易于被人體消化吸收，同時感官特性有了較大的改善；超高壓處理的食品沒有“回生”現象，滅菌效果好，便于長期保存［4］。目前，應用超高壓技術處理水產品使其達到滅菌效果的研究逐年增多，本研究擬在保證食品衛生安全的條件下，對牡蠣肉進行超高壓處理，最大程度的保持牡蠣肉原有的品質、風味、色澤，為牡蠣精深加工高值化利用探索一條新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）購于湛江霞山東風水產批發市場；海水取自湛江東海島龍海天海濱的海水井；真空包裝袋（材質：PE+PET雙層復合，厚度：雙面0.14mm） 河北新興塑業；平板計數瓊脂北京陸橋公司。

HPP.L2-600/0.6型超高壓設備天津華泰森淼生物工程技術有限公司；SJY-UV01G型紫外殺菌器廣州百諾環保技術有限公司；HY-002-2A型臭氧發生器廣州佳環電器科技有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海華線醫用核子儀器有限公司；SPX-150B-2型生化培養箱、SW-CJ-2FD型超凈工作臺上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DZQ型單室真空封口機上海申越包裝機械制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1牡蠣的預處理

1.2.1.1海水的預處理海水靜置24h后抽濾，再經過紫外殺菌器（10W，0.2T/h）進行殺菌處理，制得無菌海水備用。

1.2.1.2牡蠣的預處理［5-6］選取長度12～14cm的香港牡蠣，用海水洗凈表面泥沙及附著物后，放入預處理過的海水中，體積按照牡蠣∶水=1∶10，通入空氣，輔助臭氧（濃度0.05%）殺菌處理，凈化處理24h，每4h換一次無菌海水。凈化處理結束后人工開殼取牡蠣肉，放入臭氧濃度為0.05%的冰生理鹽水中（4℃），洗去黏液及黑邊，瀝干表面水分后真空包裝。取樣進行微生物檢測，牡蠣肉的菌落總數為3.2718g（cfu/g），大腸菌群為7MPN/100g。

1.2.2超高壓處理［7］為保證每組實驗中微生物種類、數量一致，每次實驗用牡蠣均一次性處理。將經過預處理的牡蠣肉（12～15g/只）裝在真空包裝袋中（每袋2只），置于超高壓處理釜中，設定壓力為100、200、300、400、500MPa（升壓速度為30MPa/s），保壓時間分別為5、10、15、20、25、30m in，溫度分別為20、30、40、50、60℃，做壓力單因素時，固定保壓時間為10min，處理溫度30℃；做保壓時間單因素時，固定處理壓力為300MPa，處理溫度30℃；做溫度單因素時，壓力為300MPa，保壓時間10m in。每個處理條件做3次平行。

1.2.3殺菌實驗設計本研究中超高壓的殺菌效果以菌落總數對數（lg cfu/g）和大腸菌群（MPN/100g）為響應指標，考慮的主要因素包括處理壓力、保壓時間和處理溫度。采用Box-Behnken設計來確定人工神經網絡優化需要輸入的訓練數據，因素水平編碼表見表1［8-11］。

表1　因素水平編碼表Table 1　Code of factors and levels

1.2.4微生物檢測根據國家食品微生物檢驗標準（GB 4789.2-2010）進行菌落總數和大腸菌群的測定。

1.3數據分析

實驗數據處理及作圖采用Origin 8.5和JMP 7.0數據處理軟件中的神經網絡平臺。每個實驗平行3次，數據用“平均數±標準差”表示。

2　結果與分析

2.1超高壓處理壓力對菌落總數和大腸菌群的影響

在超高壓對牡蠣肉滅菌的過程中，處理壓力是影響滅菌效果的重要因素。確定保壓時間為10m in，超高壓處理溫度30℃，取樣分析牡蠣肉的菌落總數和大腸菌群，探討處理壓力對滅菌效果的影響。

圖1　超高壓處理對菌落總數和大腸菌群的影響Fig.1　Relationship between the pressure and total bacteria and Coliforms

大腸菌群是革蘭氏陰性菌，其細胞壁較薄，肽聚糖的質量分數較少，脂類的質量分數高，當受到超高壓作用時，細胞壁受到機械損傷更容易，所以細胞更容易死亡，因此，超高壓加工處理對大腸菌群的殺滅效果十分顯著。

從圖1中可以看出，相同處理溫度和保壓時間下，隨著處理壓力的增加，菌落總數明顯降低，壓力達到300MPa時，菌落總數從3.2718lg cfu/g降低到2.77542lg cfu/g，即殺菌率達到68.13%，這主要是因為高壓使細胞膜、細胞壁都發生變化進而達到殺滅微生物的目的；當處理壓力達到500MPa時，殺菌率達75.08%。處理壓力從300～500MPa時殺菌率只增加了7%。超高壓處理后牡蠣肉的大腸菌群均為零。這與張曉敏［15］的研究結果相符。

參照《國家海水貝類衛生標準》（GB 2744-1996）和貝類凈化技術規范（SC/T 3013-2002，中華人民共和國水產行業標準），貝類衛生指標分別是菌落總數＜5×105cfu/g，大腸菌群＜300MPN/100g。通過預處理后牡蠣肉的大腸菌群僅為7MPN/100g，從圖1中可看出，大腸菌群對壓力及其敏感，在200MPa處理10min就可殺滅全部大腸菌群。這個結果與上述標準的要求是十分吻合的。綜合考慮加工處理成本和設備的安全性，所以，處理壓力選擇300MPa。

2.2保壓時間對菌落總數和大腸菌群的影響

確定處理壓力為300MPa，處理溫度30℃，取樣分析牡蠣肉的菌落總數和大腸菌群，探討保壓時間對滅菌效果的影響。

圖2　超高壓處理保壓時間對菌落總數的影響Fig.2　Relationship between the pressure time and total bacteria

從圖2可以看出，在相同處理溫度和壓力條件下，隨著保壓時間的延長，菌落總數逐漸降低。300MPa處理保壓時間達到20min時，菌落總數從3.2718lg cfu/g降低到2.49554lg cfu/g，殺菌率達到83.26%；保壓時間增加到30min時，殺菌率可達到84.60%。保壓時間從20m in增加到30m in殺菌率只增加了1.34%；超高壓處理后牡蠣肉的大腸菌群均為零；綜合考慮加工處理成本，保壓處理時間選擇20m in。

2.3處理溫度對菌落總數和大腸菌群的影響

預先將超高壓處理的水介質和真空包裝的牡蠣肉加熱到不同的實驗溫度后再進行超高壓處理。確定處理條件為壓力為300MPa，保壓時間10m in，取樣分析牡蠣肉的菌落總數和大腸菌群，探討處理溫度對滅菌效果的影響。

圖3　超高壓處理溫度與菌落總數的關系Fig.3　Relationship between the temperature and total bacteria

從圖3可以看出，在相同處理壓力和保壓時間條件下，隨著處理溫度的提高，菌落總數迅速降低，超高壓處理后牡蠣肉的大腸菌群均為零。當溫度提高到30℃時，菌落總數從3.2718lg cfu/g降低到2.77542lg cfu/g，殺菌率已達到68.13%；當溫度提高到40℃以上時，由于超高壓和蛋白質加熱變性的雙重疊加效應，殺菌率可達到69.47%；但是牡蠣的口感、色澤和風味已經有了較明顯變化。綜合考慮加工處理成本和產品品質，所以，選擇處理溫度為30℃。

2.4Box-Behnken設計及結果

根據表1采用Box-Behnken實驗設計來確定人工神經網絡優化需要輸入的訓練數據，實驗設計與結果見表2所示。

表2　實驗設計及結果Table 2　Experimental design and results

2.5神經網絡模型的建立

根據實驗數據情況，選擇“K折疊”交叉驗證的方法擬合相應目標的神經網絡模型，在經過多次神經網絡訓練后，確定采用3×3×1結構的三層神經網絡，見圖4，即3個輸入神經元，分別代表壓力（X1）、保壓時間（X2）和貯藏溫度（X3）；3個隱含層神經元；1個輸出神經元，代表實驗指標菌落總數（Y）。設置各參數值，隱藏節點數3，過擬合罰項0.001，歷程數16，最大迭代數50，收斂準則0.00001，執行神經網絡模型的擬合迭代過程，擬合決定系數R2值為0.99985，說明3× 3×1結構的三層神經網絡模型具有較好的預測能力。

圖4　神經網絡結構圖Fig.4　Structure of artificial neural network（ANN）

2.6神經網絡模型的優化與分析

為了研究X1、X2、X33個條件對菌落總數Y1的影響，先固定其中的1個因素為0水平，利用JMP 7.0軟件中的曲面刻畫器作三維曲面圖，然后對其進行正投影處理，結果見圖5。

有研究表明，高壓可以引起細胞形狀、細胞膜及細胞壁的結構和功能的變化，細胞膜的變化可能是壓力引起微生物死亡最主要的原因之一。

從圖5（a、b）可以看出，壓力在100～300MPa時，隨著壓力的升高滅菌效果越明顯。在壓力接近500MPa時，滅菌效果趨于平緩。這是由于在壓力作用下，細胞膜的通透性發生變化，使得發生功能障礙，導致細胞內容物流失，氨基酸攝取受阻［12］。阻遏了細胞的新陳代謝過程，細胞分裂減慢，導致微生物生長滯后，甚至停止。超高壓也可使細胞壁遭到不同程度的破壞［13］。壓力能夠使微生物細胞蛋白質合成受到抑制，酶發生變性，同時使脂膜流動性降低，進而殺滅微生物［14］。同時超高壓影響DNA復制，壓力直接影響著微生物的遺傳與變異，影響基因表達和蛋白質的合成，這些都是導致壓力的增大，超高壓滅菌效果越好的原因。

從圖5（a、c）可以看出，在相同壓力條件下，隨著保壓時間的延長，同樣可以使菌落總數有明顯的降低趨勢。

從圖5（b、c）可以看出，隨著處理溫度的提高，菌落總數呈下降趨勢。加熱使微生物細胞內的蛋白質受熱凝固，失去新陳代謝的能力。同時高溫能夠使酶失活，進而達到殺滅微生物的目的。

圖5　壓力、保壓時間和處理溫度對殺菌效果的影響Fig.5　Effectof pressure，time and time on bacteria inactivation

以上分析可知，壓力對超高壓殺菌效果的影響最大，保壓時間和處理溫度次之。在尋求超高壓較好殺菌工藝參數時，既要考慮殺菌效果，又要考慮設備的運行成本。因此，本研究以菌落總數為指標，借助JMP7.0軟件的預測刻畫器對超高壓殺菌工藝參數進行優化，結果見圖6。

圖6　神經網絡預測刻畫圖Fig.6　Prediction plotof the neural network

由圖6可知，當壓力接近350MPa時，保壓時間接近20m in，處理溫度30℃時，滅菌效果提升并不明顯，這是由于超高壓已發揮最大作用。考慮到運行成本，所以選擇350MPa，保壓時間為20m in，處理溫度30℃，即能達到最好的殺菌效果（殺菌率85.13%）。這與張曉敏和Lopez-Caballero M的研究結果接近［15-17］。

2.7神經網絡模型的驗證

為了驗證建立的神經網絡模型是否符合實際情況，利用建立好的神經網絡模型對結果進行預測，然后與實驗結果進行比較和檢驗（處理條件為壓力350MPa，保壓時間20min，處理溫度30℃），以檢驗人工神經網絡預測的準確性和穩定性，結果見表3。

表3　神經網絡模型的預測值與試驗值的比較Table 3　Comparison of predicted values and experimental values of artificial neural network（ANN）

從表3可知，建立的神經網絡模型具有較好的預測能力，能較為準確地預測殺菌效果，預測值與實驗值的相對誤差較小，因此可利用該神經網絡對整個超高壓殺菌過程進行預測分析。

3　結論

利用Box-Behnken實驗設計建立數據集，以菌落總數（lg cfu/g）為參考標準，借助JMP7.0軟件的神經網絡平臺建立了超高壓對牡蠣殺菌的神經網絡模型，優化的得到最佳處理工藝條件為：壓力350MPa，保壓時間為20m in，處理溫度30℃，此條件下處理能達到最好的殺菌效果，即牡蠣肉的菌落總數為2.44342lg cfu/g（殺菌率達到85.13%），大腸菌群減少為零。驗證實驗結果說明，所建立的神經網絡模型具有較好的預測能力，可準確地預測殺菌效果，預測值與實驗值的相對誤差較小（0.201%）。

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Study on the processing optim ization of ultra high pressure sterilization from oystermeat base on a neuralnetwork method

WANG Xiao-qian，ZHONG Sai-yi，QIN Xiao-m ing*，ZHENG Hui-na，ZHANG Chao-hua
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The results showed that the best p rocess cond ition was the p ressure was 350MPa for 20m in and the temperature was 30℃，the oystermeat total bacteria after p ressure treatment in this cond ition decreased from 3.2718 to 2.44342lg c fu/g（The sterilization rate was 85.13%），and Coliform s decreased from 7 to 0（MPN/100g）. Validation test results showed that the estab lished neural network model had better p rediction ability which could accurately p red ict the sterilization effec t，and the relative error of p red icted values and experimental values was small（0.201%）.

oyster；ultra high p ressure；sterilization；neuralnetwork

TS254.4

B

1002-0306（2015）06-0257-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.048

2014-07-17

王曉謙（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事海洋生物資源高值化利用方面的研究。

秦小明（1964-），男，博士，教授，主要從事海洋生物資源高值化利用方面的研究。

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS-48-07B）；廣東省科技廳（2010B020201014）；國家星火計劃十二五重大與重點項目。