響應面法優化姜黃素的提取工藝及其抗氧化活性的研究

張　艷，段雪芹，高　剛，茍學梅，王　茜，鄧家彬，周永紅，楊瑞武，*

（1.四川農業大學生命科學學院，四川雅安625014；2.四川農業大學小麥研究所，四川溫江611130）

響應面法優化姜黃素的提取工藝及其抗氧化活性的研究

張艷1，段雪芹1，高剛1，茍學梅1，王茜1，鄧家彬1，周永紅2，楊瑞武1，*

（1.四川農業大學生命科學學院，四川雅安625014；2.四川農業大學小麥研究所，四川溫江611130）

采用響應面法優化了姜黃素的提取工藝，并探討了姜黃素對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、DPPH自由基、ABTS+自由基的體外抗氧化活性。姜黃素的最佳提取工藝條件為乙醇濃度85%，超聲時間50min，液料比20∶1（mL/g）。在此條件下，姜黃素得率為1.538%。體外抗氧化實驗表明，三種姜黃素標準品具有較強的抗氧化活性且各有差異，姜黃素提取液對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、DPPH自由基、ABTS+自由基也具有較強的清除能力。

姜黃，提取，姜黃素，抗氧化活性

姜黃（Curcuma longa）為多年生草本植物，用藥歷史悠久，中藥郁金、莪術和姜黃均來源于該屬植物。中醫認為其性辛，味溫苦，可作調味品、天然色素和染料［1］，同時還具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋病毒等生物活性［2-3］。姜黃的主要活性成分是姜黃素類化合物，主要包括姜黃素（curcumin）、去甲氧基姜黃素（DMC）和雙去甲氧基姜黃素（BDMC）。近年來，姜黃素已成為國內外研究的熱點，涉及的領域也越來越廣泛。因而，從中草藥中提取和分離姜黃素受到許多機構的垂青［4-8］。目前，國內大多數姜黃屬植物姜黃素含量普遍偏低，制取純度高的工藝體系還達不到優化，且成本高，生產利潤低。為此，本研究以國內四川地區的姜黃為研究對象，采用超聲波輔助法提取總姜黃素，在單因素基礎上，通過響應面分析篩選最佳工藝條件，并采用HPLC法測定其含量，同時比較三種姜黃素標準品及姜黃素提取液的體外抗氧化活性，為國內姜黃屬藥用植物的開發與利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姜黃采自四川地區，現種植于四川農業大學農場，采集姜黃塊根洗凈，于65℃干燥箱中烘干，用粉碎機粉碎，過80目篩，備用；姜黃素對照品購于中國生物制品藥品檢定所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2-2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

LV-10AVP高效液相色譜儀（由DGU-12A脫氣機，兩個LC-10ATVP溶劑輸送泵、SPD-10AVP紫外-可見檢測器、SCL-10AVP系統控制器、SIL-10ADVP自動進樣器、混合器和柱溫箱以及LCsolution工作站組成），色譜柱為Dima C18（5μm，4.6mm×150mm）、UV-1750可見-紫外分光光度計日本島津；FA1004電子分析天平上海振興化工一廠；GSY-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋北京市醫療設備廠102微型植物粉碎機天津泰斯特儀器有限公司；SZ-97自動二重純水整流器上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1提取工藝取細粉約0.1g，精密稱定后，置5m L離心管中，40W超聲提取，12000r/m in離心4m in，重復3次，合并收集上清液并定容至100m L。將提取液過0.45mm微孔濾膜，取續濾液定容備用［9］。采用HPLC法［10］測定姜黃素含量。

1.2.2單因素實驗設計

1.2.2.1乙醇濃度對姜黃素得率的影響在液料比20∶1（m L∶g），40W超聲提取30m in的條件下，研究40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%不同乙醇濃度對姜黃素得率的影響。

1.2.2.2超聲時間對姜黃素得率的影響超聲功率為40W，乙醇濃度80%，液料比20∶1條件下，研究5、10、20、30、40、50、60、70m in不同超聲時間對姜黃素得率的影響。

1.2.2.3液料比對姜黃素得率的影響在乙醇濃度為80%，40W超聲時間30m in條件下，研究3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1m L/g不同液料比對姜黃素得率的影響。

1.2.3響應面實驗設計在單因素的基礎上根據CCD實驗設計原理，選取乙醇濃度，超聲時間，液料比對總姜黃素得率的影響較大的3個因素作響應面分析。實驗因素水平見表1。

表1　響應面設計因素水平表Table 1　Independent variables and their levels used in the central composite design（CCD）

1.2.4HPLC法測定姜黃素含量色譜柱為Dima C18（5μm，4.6mm×150mm）流動相B為乙腈溶劑，流速為0.9m L/m in；柱溫40℃，檢測波長為422nm，進樣量為10μL。

取BDMC、DMC、Cur標準品精密稱取各5mg，以無水乙醇溶解，定容到50m L，然后分別配制成102μg/m L溶液，棕色瓶中于4℃冰箱中儲存備用。在上述色譜條件下，精密吸取標準品溶液和樣品溶液10μL注入色譜儀，記錄色譜圖，根據色譜圖峰面積和回歸方程計算姜黃素含量及得率。

依次取10、20、30、40、50μL的標準品溶液進樣，記錄色譜峰面積。在回歸方程y=ax+b中，x代表進樣量（μg），為橫坐標，y代表峰面積，為縱坐標。

1.2.5總姜黃素體外抗氧化活性

1.2.5.1O2-·的抑制能力的測定具體步驟參照Beauchamp［11］與Zhishen等［12］的方法。用0.05mol/L pH= 7.4的PBS緩沖液為溶劑，配制3.3×10-6mol/L核黃素，0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蘭（NBT）。取上述3種溶液各2.0m L，加入各種濃度的姜黃素溶液1.0m L，空白管以1.0m L緩沖液代替樣品溶液。光照30m in，560nm處測吸光度。3次重復。計算清除率。

超氧陰離子自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中，A0：空白管的吸光度，A：為各姜黃素的吸光度。

1.2.5.2 ·OH清除能力的測定1m L姜黃素溶液依次加入2m L 6mmol/L FeSO4、2m L 6mmol/L H2O2，混勻，靜置10m in，再加入6mmol/L水楊酸2m L，混勻，靜置30m in，510nm處測其吸光度（Ai），蒸餾水代替水楊酸、姜黃素溶液測其吸光度Aj、A0。以VC做陽性對照，重復3次。計算清除率。

1.2.5.3DPPH自由基清除能力的測定參照Blois，Choi et al.，Su等［13-15］方法，5m L 0.03g/L的DPPH甲醇溶液，加上0.05m L姜黃素溶液。暗箱反應30m in后，517nm測吸光值。重復3次，計算清除率。

式中，A0：空白溶液吸光值（沒有加姜黃素溶液），A1：姜黃素溶液吸光值。

1.2.5.4ABTS+自由基清除能力的測定參照Shirwaikar和Re［16-17］的方法，將等量的7mmol/L ABTS+溶液與2.45mmol/L過硫酸鉀（K2S2O8）混合并置于暗處12～16h。甲醇稀釋ABTS+至其在734nm處吸光度為0.7±0.02。將姜黃素溶液加入2m L ABTS+6m in后測吸光度（Ai），2m L ABTS+和25μL甲醇混合后517nm處測吸光度（A0）；2m L甲醇溶液與25μL樣品液混合測吸光度（A1），計算：

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1乙醇濃度對姜黃素得率的影響由圖1可知，隨著乙醇濃度增加，姜黃素得率逐漸增加，當乙醇濃度超過80%后姜黃素得率開始下降，因此，乙醇濃度選擇80%比較適宜。

2.1.2超聲時間對姜黃素得率的影響由圖2可知，隨著超聲時間延長，姜黃素得率逐漸升高，在超聲時間為50m in時，姜黃素得率最高，因此，超聲時間選擇50min比較適宜。

圖1　乙醇濃度對姜黃素得率的影響Fig.1　The curcuminoids extraction yield effects by ethanol concentration

圖2　超聲時間對姜黃素得率影響Fig.2　The curcuminoids extraction yield effects by ultrasonic time

2.1.3液料比對姜黃素得率的影響由圖3可知，在3∶1～20∶1時，隨著液料比的增加，姜黃素得率呈上升趨勢，但液料比大于20∶1后，姜黃素得率逐漸下降。因此，液料比選擇20∶1比較適宜。

圖3　液料比對姜黃素得率的影響Fig.3　The curcuminoids extraction yield effects by liquid-to-material ratio

2.2響應面法優化與分析

2.2.1響應面法優化實驗結果利用軟件Design Expert 8.05的CCD中心組合實驗設計進行響應面分析，得最佳工藝參數，優化實驗結果見表2。

表2　實驗結果與預測值表Table 2Experimental results and predicted for central composite design（CCD）

2.2.2回歸模型的建立及顯著性檢驗對表2的實驗數據進行多元回歸擬合獲得二次多項回歸方程：

Y=15.21+0.53A+0.57B+0.49C-0.47AB+0.39AC-0.53BC-0.74A2-0.54B2-0.49C2

對20個實驗點進行響應面方差分析，見表3。

表3　回歸方程方差分析表Table 3　Analysis of variance for COD removal

由表3可知，回歸模型是極顯著的（p＜0.01），且該模型有較高的相關系數（R2=0.9292）擬合度大于92.92%，失擬項不顯著，則該模型能夠反映響應值的變化，對實驗擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。

2.2.3響應曲面分析圖4反映了各因素交互作用對響應值的影響。由3組響應面圖可知，姜黃素得率隨著其中兩因素的增加先上升，當達到一定水平時，姜黃素得率增加緩慢，隨后下降。乙醇濃度與超聲時間之間的交互作用、乙醇濃度與液料比之間的交互作用及超聲時間與液料比之間的交互作用對姜黃素得率有顯著影響。

圖4　各兩因素交互影響姜黃素得率的響應面圖Fig.4　Response surface of cross-interaction among two factors on the curcuminoids extraction yield

回歸模型預測總姜黃素得率最高時的乙醇濃度85.45%、超聲時間49.50m in、液料比18.54∶1，姜黃素得率15.45mg/g，即1.545%。按照該條件進行驗證實驗，為方便操作乙醇濃度設為85%，超聲時間50m in，液料比20∶1，5次平行實驗的姜黃素得率實測值1.538%與理論預測值基本吻合，說明響應面優化得到的超聲提取條件參數準確可靠，具有實用價值。

2.3HPLC法測定三種姜黃素含量

由圖5、圖6可知，3個顯著峰出現的時間相同，所以3個峰分別對應相同物質。由圖6可見1、2、3峰分別是Cur、DMC、BDMC。

圖5　三種姜黃素標準品乙醇溶液的HPLC圖譜Fig.5　Typical HPLC chromatogram of three curcumin standards with ethanol solvent

圖6　姜黃素提取液的HPLC圖譜Fig.6　Typical HPLC chromatogram of the curcuminoids extract with ethanol solvent

由表4可見，這三個標準品都呈現出良好的線性關系。根據樣品的色譜圖峰面積和回歸方程得總姜黃素含量。

表4　3種姜黃素標準品的回歸方程Table 4　Regression equations of three curcumin standards

2.4體外抗氧化活性

2.4.13種姜黃素標準品的抗氧化活性由表5可知，3種姜黃素標準品對4種自由基具有較強的清除作用，尤其BDMC對ABTS+的清除能力強于VC，同時Cur對DPPH·、·OH，DMC對ABTS+的清除作用也較強。所以3種姜黃素具有較強的抗氧化作用。

表5　3種姜黃素標準品及VC的4種抗氧化方法結果匯總Table 5　The in vitro antioxidantof three curcumin standards and VC

2.4.2姜黃素提取液的抗氧化活性由圖7可知，在1～8μg/m L時，姜黃素提取液對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·的清除率隨質量濃度增大而增大，且在1～3μg/m L時，姜黃素提取液對ABTS+·的清除率高于VC，在1～5μg/m L時，總姜黃素對·OH的清除率也高于VC。所以姜黃素提取液具有較強的抗氧化作用。

圖7　姜黃素提取液與VC對4種自由基的清除效果Fig.7　Scavenging effects of curcuminoids extractand VCto four radicals

3　結論與討論

通過中心組合設計及響應面分析得到了較優的提取工藝條件：乙醇濃度85%，超聲時間50m in，液料比20∶1（m L/g），實際提取姜黃素得率1.538%，與預測值1.545%基本一致。高秀強等［18］采用加熱回流提取，HPLC法測定姜黃素含量，得率為1.325%。唐小清等［19］采用超聲提取，紫外分光光度法測定含量，得率為1.968%，提取率較高，經分析得出，本實驗采用鮮姜黃，姜黃素含量比干藥材姜黃小，且HPLC法測定的是姜黃素三種單體的含量總和，所以本實驗得率1.538%較高，具有一定的實用價值。

三種姜黃素單體抗氧化活性有差異，總體抗氧化活性較強。同時，姜黃素提取液在質量濃度為1～8μg/m L時，對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·有較強的清除能力，并且與質量濃度呈正相關關系。且在1～3μg/m L時，總姜黃素對ABTS+·的清除能力高于VC，在1～5μg/m L時，對·OH的清除能力也高于VC。實驗證明，在一定濃度范圍內，姜黃素提取液對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·也具有較強的清除能力，所以從四川地區的姜黃中得到的姜黃素作為天然抗氧化劑具有進一步開發利用的價值。

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Study on optim ization of extraction process for curcum inoids by response surface method and its antioxidant activity

ZHANG Yan1，DUAN Xue-qin1，GAO Gang1，GOU Xue-mei1，WANG Qian1，DENG Jia-bin1，ZHOU Yong-hong2，YANG Rui-wu1，*
（1.College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Triticeae Research Institute，Sichuan Agriculture University，Wenjiang 611130，China）

Response surface methodology was used to op tim ize the extraction p rocess for curcum inoids.The antioxidant activity of curcum inoids was evaluated using superoxide anion（O2-·），hyd roxyl（·OH），DPPH and ABTS+rad icalscavenging.The results ind icated that the op timalextraction cond itions were ethanolconcentration（V/V）85%，ultrasonic time 50m in，and material-to-liquid ratio 20∶1（m L/g）.Under these extraction cond itions，maximum yield of curcum inoids of 1.538%was ob tained.The antioxidant experiment in vitro demonstated that the antioxidant ac tivity of three curcum in standards were strong and different.Meanwhile the curcum inoids extrac talso have a better ability to scavenge superoxide anion（O2-·），hyd roxyl（·OH），DPPH and ABTS+radical.

Curcuma longa；extraction；curcum inoids；antioxidantac tivity

TS219

B

1002-0306（2015）06-0269-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.051

2014-07-03

張艷（1989-），女，碩士研究生，主要從事植物資源學方面的研究。

楊瑞武（1969-），男，博士，教授，主要從事植物系統與進化方面的研究。

國家自然科學基金（31270243）。