乙醇體系中酶抑制法檢測氨基甲酸乙酯的研究

張佳佳，劉麗斌，劉智鈞，黃秋婷，黃惠華，*（.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州50640；.廣州市酒類檢測中心，廣東廣州5060）

乙醇體系中酶抑制法檢測氨基甲酸乙酯的研究

張佳佳1，劉麗斌1，劉智鈞1，黃秋婷2，黃惠華1，*
（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.廣州市酒類檢測中心，廣東廣州510160）

研究了在乙醇-水溶液和乙醇-緩沖液體系中，以乙酰膽堿酯酶對底物碘化硫代乙酰膽堿進行水解。根據氨基甲酸乙酯對乙酰膽堿酯酶的抑制率與吸光度的線性關系，測定體系中氨基甲酸乙酯的含量。實驗發現，在乙醇-水溶液中，此方法不可行；而在低濃度乙醇-緩沖液體系中，氨基甲酸乙酯對乙酰膽堿酯酶的抑制率與其濃度在一定范圍內呈線性關系。在5%、10%和15%乙醇-緩沖液體系中測定氨基甲酸乙酯的線性范圍分別為2～10、1～5、1～5mg/L，相關系數在0.992～0.997之間，最低檢出限為0.00895、0.04259、0.02916mg/L，RSD分別在1.41%～2.17%、0.34%～0.55%和3.61%～6.44%范圍內。該法快速簡便，所用儀器設備簡單，檢測成本低。本研究為酒精飲料及發酵食品中氨基甲酸乙酯的快速、簡便、低成本檢測方法的研究及相關產品的開發提供一定的理論和數據支持。

乙酰膽堿酯酶，酶抑制法，氨基甲酸乙酯，乙醇

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，簡稱EC，又稱Urethane），是發酵食品（如面包、奶酪、醬油等）和酒精飲料（如中國黃酒、日本清酒等）生產過程中的伴隨產物［1］。早期研究表明，EC對于老鼠、猴子和倉鼠等多種動物具有基因毒性和致癌性，對人類存在潛在的致癌風險［2］。Nettleship在1943年證明了它是一種致癌物質［3］。2002年聯合國糧農組織將其列為重點監控物質并制定了在食品中含量不得超過20μg/L的國際標準［4］。2007年國際癌癥研究機構認定EC為2A類致癌物質，對人類具有潛在的致癌作用，與丙烯酰胺危險性同等［5］。

目前國內外對于酒精飲料中EC的檢測方法有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜法、傅立葉變換紅外色譜法等［6］，但尚不能滿足快速、簡便、低成本的要求。酶抑制法是蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測方法［7］。研究表明，酶抑制法可以用于酒中的EC含量的檢測，并且在緩沖液體系中通過氧化劑溴水衍生，可以明顯增大抑制率［8］。

一般來說，酶溶于水，而不溶于有機溶劑。同時，有機溶劑會降低許多酶的催化活性。酶和底物在有機溶劑中的擴散限制、立體障礙和酶構象的可變性都會對酶的催化活性造成影響［9］，因此酒中復雜的有機溶劑對酶抑制法的影響需要進行深入研究。乙醇是酒中含量最大的有機溶劑，不能忽略其在酶抑制法測定EC時對酶活的影響。

國內外關于酶抑制法應用中有機溶劑對AChE活力的影響的研究報道不多，而對于酶抑制法檢測EC時有機溶劑對酶活的影響方面的報道更少，基本上都未考慮有機溶劑對AChE的影響。因此，針對于這種現狀，以及EC快速、簡便的檢測方法和有機溶劑對酶活的影響的重要性，本研究基于酶抑制法，在乙醇體系中研究EC的檢測方法，探尋乙醇對酶抑制法測定EC的影響，為進一步開發和研究快速、簡便、低成本檢測EC的方法及產品提供理論和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

碘化硫代乙酰膽堿（ATCHI，10mg/mL）、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB，10mg/mL，溶解于10mg/mL的碳酸氫鈉溶液中）、乙酰膽堿酯酶（AChE）（BR，酶活力＞200U/g，溶解于0.1mol/L pH9.0磷酸鹽緩沖液中，13mg/mL）廣州菲博生物科技有限公司；磷酸二氫鈉（AR）、磷酸氫二鈉（AR） 天津市科盟化工工貿有限公司；溴水（AR）、亞硝酸鈉（AR） 天津市福晨化學試劑廠；氫氧化鈉（AR）南京化學試劑有限公司；無水乙醇（AR） 國藥集團化學試劑有限公司；碳酸氫鈉（AR） 天津市化學試劑一廠。

UV1800型紫外-可見分光光度計日本島津公司；PHS-25型pH計上海虹益儀器儀表有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器上海精科儀器有限公司；BSA124SCW分析天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1乙酰膽堿酯酶活性的測定參照Ellman法［10］，于試管中加入5mL 0.1mol/L pH9.0 PBS，再加入100μL乙酰膽堿酯酶溶液（13mg/mL），混勻，于30℃水浴保溫15min，加入100μL DTNB（10mg/mL）、100μL碘化硫代乙酰膽堿（10mg/mL），混合后，立即在412nm處比色，在3min內每隔0.1min連續測定吸光度值，記3min前后的吸光度變化值△A，每組3個平行樣取平均值。應使AChE空白對照樣△A3min＞0.3才可繼續操作。

乙酰膽堿酯酶活力定義為在30℃，0.1mol/L pH9.0的PBS中，每毫克酶蛋白每分鐘分解底物碘化硫代乙酰膽堿的微摩爾數，按式（1）計算酶活力：

式中：V—反應體系的總體積，本體系為5.3×10-3L；△A—3min前后的吸光度變化值；T—反應時間，本法為3min；v—酶活測定時所用酶液體積，本法為0.1mL；ε—黃色產物摩爾消光系數，為1.36×104L/（mol×cm）；L—比色皿光程（1cm）c—酶液濃度，mg/mL。

1.2.2酶抑制率的測定在試管中加入5mL樣品溶液，加入100μL氧化劑溴水（3%）-氫氧化鈉（0.01mol/L）［8］，混勻，作用10min，用300μL 10%（w/v）亞硝酸鈉還原過量的氧化劑［11］，再加入100μL AChE溶液，混勻，加入100μL DTNB溶液、100μL碘化硫代乙酰膽堿溶液，混勻，立即在412nm處比色，在3min內每0.1min記錄吸光度值。

以含有EC的磷酸鹽緩沖溶液作為樣品，以不含EC的磷酸鹽緩沖溶液作為參照樣，按式（2）計算酶抑制率：

式中：△Ac—參照樣3min后與3min前吸光值之差；△As—樣品3min后與3min前吸光值之差。

1.2.3不同濃度乙醇溶液對AChE的抑制配制5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%乙醇-水溶液、乙醇-緩沖液（PBS），分別在上述酒精溶液中，按1.2.1的方法測定酶活，以不加乙醇的蒸餾水或緩沖液（PBS）做對照。按下式（3）計算抑制率：

式中：△A—酒精溶液中3min前后的吸光度變化值；△A0—對照管3min前后的吸光度變化值。

1.2.4低濃度乙醇溶液中AChE的Km、Vmax的測定配制0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3mol/L碘化硫代乙酰膽堿，研究在5%、10%、15%乙醇-水溶液、乙醇-緩沖液（PBS）中、30℃保溫15min的反應條件下，不同底物濃度的產物吸光度變化值規律。反應速度V按式（4）計算：

式中：T—反應時間，本法為3min；ε—黃色產物摩爾消光系數，為1.36×104L/（molcm）；L—比色皿光程（1cm）。

根據Hanes-Woolf作圖法求Km、Vmax。

1.2.5低濃度乙醇溶液中EC對AChE的抑制的測定選取5%、10%、15%乙醇-水溶液、乙醇-緩沖液（PBS），分別配制0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10mg/L的EC濃度，按1.2.2測定酶抑制率，繪制出工作曲線。

1.2.6檢出限的確定分別在5%、10%、15%乙醇-緩沖液（PBS）中，首先做6次空白測定，獲得空白測定結果的標準差SD空白，按公式（檢出標準=t空白×SD空白）計算檢出標準。然后分別在5%乙醇-緩沖液（PBS）中對2mg/L EC標準溶液進行6次測定，在10%、15%乙醇-緩沖液（PBS）中對0.75mg/L EC標準溶液進行6次測定，獲得測定結果的標準差SD，查出相應的t，按公式（檢出限=檢出標準+SD×t）計算檢出限。

1.2.7精密度的確定分別在5%、10%、15%乙醇-緩沖液（PBS）體系中，選擇2.0、3.0、5.0、10mg/L四個濃度EC標準溶液，按1.2.2測定酶抑制率，每一濃度重復測定6次，求出相對標準偏差。

1.2.8數據處理方法實驗結果采用軟件Excel 2007進行數據處理并作圖分析。

2　結果與分析

2.1不同濃度的乙醇溶液對AChE的抑制情況

由圖1和圖2可知，在乙醇-水溶液和乙醇-緩沖液（PBS）體系中，隨著乙醇濃度的增加，乙酰膽堿酯酶的酶活力都呈不同程度減小的趨勢，當乙醇濃度增加到一定濃度后，呈波動狀態。在乙醇-緩沖液（PBS）體系中，當乙醇濃度增加至10%時，乙醇對乙酰膽堿酯酶的抑制率接近50%；當乙醇濃度增加至20%時，抑制率已達到了86%。在乙醇-水溶液中，當乙醇濃度增加至10%時，乙醇對酶的抑制率接近10%，當乙醇濃度繼續增大至20%時，抑制率達到了88%。但乙醇濃度在20%～50%之間時，乙醇-水溶液比乙醇-緩沖液（PBS）體系中酶抑制率高。

圖1　乙醇溶液濃度對酶活力的影響Fig.1　Influence of concentration of ethanol on enzyme activity

圖2　乙醇溶液濃度對AChE的抑制率的影響Fig.2　Influence of concentration of ethanol on AChE inhibition rate

乙醇導致酶活下降的原因可能是：一是當體系中乙醇濃度增加時，乙醇可能會奪取酶分子表面的必需水，從而導致酶活力下降［12］；二是由于酶不溶于大部分的有機溶劑，乙醇濃度過大時，還會出現懸浮顆粒狀，酶與底物的接觸受到擴散限制，或者酶活中心可能被其他酶分子遮擋住，從而導致酶活下降；三是有機溶劑介電常數低，疏水性改變了乙酰膽堿酯酶分子與水分子之間的非共價作用力，使得酶分子之間靜電作用力增加，結構趨于剛性，分子柔性下降，影響了酶活力［13］。

分析可知，酶抑制法要想用于檢測乙醇體系中的EC含量，必須在低濃度乙醇體系中進行，或者使用大孔吸附樹脂吸附乙醇等方法進行前處理降低乙醇的濃度，使得該方法可以應用到更大范圍的酒精飲料和發酵食品中EC的檢測上；或者也可以采用一定方法將EC萃取出來，再應用酶抑制法進行測定。因此，后續實驗中選擇5%、10%、15%的低乙醇溶液體系進行酶抑制法的實驗。研究乙醇對酶活的影響，為進一步分析有機體系對酶抑制法的影響提供部分數據和理論支持，有利于完善酶抑制率法在酒中檢測EC的應用。

2.2低濃度乙醇對AChE的Km、Vmax的影響

2.2.1乙醇-水溶液體系中低濃度乙醇對AChE的Km、Vmax的影響圖3所示為5%、10%、15%乙醇-水溶液中，AChE的米氏方程。0%（PBS）、5%、10%、15%乙醇-水溶液中AChE的Km、Vmax的對比如表1所示。

圖3　不同濃度乙醇-水溶液中AChE的米式方程Fig.3　M type equation at different concentrations in ethanol aqueous solution

表1　不同濃度乙醇-水溶液中AChE的Km、VmaxTable 1　Kmand Vmaxof AChE at different concentrations in ethanol aqueous solution

由圖3和表1可知，與緩沖液（PBS）體系相比，乙醇-水溶液體系中乙酰膽堿酯酶的Vmax降低了一個數量級，Km也明顯比緩沖液（PBS）中的Km值小，并且隨著乙醇濃度的增加，Vmax呈減小的趨勢，但是Km隨乙醇濃度增加不斷地增加。可能是因為乙醇的加入，由于擴散限制影響了酶與底物的接觸，從而降低了反應速度，Km值也自然增大。

2.2.2乙醇-緩沖液（PBS）溶液體系中低濃度乙醇對AChE的Km、Vmax的影響圖4所示為5%、10%、15%乙醇-緩沖液（PBS）溶液中，AChE的米氏方程。0%（PBS）、5%、10%、15%乙醇-緩沖液（PBS）中AChE的Km、Vmax的對比如表2所示。

由圖4和表2可知，在5%和10%的乙醇-緩沖液（PBS）體系中乙酰膽堿酯酶的Vmax與緩沖液（PBS）體系中的Vmax相比，稍微增加，Km明顯增大。當乙醇濃度達到15%時，與緩沖液（PBS）中的Vmax、Km相比，乙醇-緩沖液（PBS）體系中酶的Vmax明顯減小，Km明顯增大。也就是酶活力的大小與體系中乙醇含量的關系呈現鐘形曲線。可能是酶在有機溶劑中的構型更加剛性，且限制了部分水相中的熱不可逆失活的共價作用，酶穩定性增加［14］。所以低濃度乙醇中雖然酶活稍有抑制，但總體還是增加，但乙醇濃度過高時，大部分酶活被抑制，且濃度可能已經過了提高酶穩定性的最佳比例，所以Vmax下降。

圖4　不同濃度乙醇-緩沖液中AChE的米式方程Fig.4　M type equation at different ethanol concentrations in ethanol-buffer

表2　不同濃度乙醇-緩沖液中AChE的Km、VmaxTable 2　Kmand Vmaxof AChE at different ethanol concentrations in ethanol-buffer

2.3低濃度乙醇溶液中EC對AChE的抑制情況

在乙醇-水溶液體系中，EC對AChE的抑制情況如圖5所示。

由圖5可知，在5%的乙醇-水溶液中，按照1.2.2加入溴水處理做對照組后，吸光值與時間的關系并不呈直線，而是無線性規律的緩慢增長的曲線；加入EC的組也出現相同的情況。因此，吸光度隨時間的變化曲線并不能反映出生成物的含量隨時間的變化，也就無法反映出EC對AChE的抑制情況。在10%和15%的乙醇-水溶液體系中測定時也出現了這種情況。所以無法做出在乙醇-水溶液體系中的工作曲線。這種現象可能是由于乙酰膽堿酯酶對體系pH的要求比較高，也可能是不符合溴水反應或者DTNB顯色的反應條件。因此，酶抑制率法不能應用在乙醇-水溶液體系中。

在乙醇-緩沖液（PBS）體系中，EC對AChE的抑制情況，即工作曲線如圖6所示，EC對AChE的抑制率線性方程如表3所示。

圖6　不同濃度乙醇-緩沖液中EC的工作曲線Fig.6　Work curve of EC at different ethanol concentrations in ethanol-buffer

表3　不同濃度乙醇-緩沖液中EC的工作曲線Table 3　Work curve of EC at different ethanol concentrations in ethanol-buffer

由圖6和表3可知，在5%、10%和15%的乙醇-緩沖液（PBS）體系中，EC對AChE的抑制率與EC的濃度呈良好的線性關系。相關系數在0.992～0.997之間，乙醇濃度為5%時，線性范圍是2～10mg/L；乙醇濃度為10%和15%時，線性范圍是1～5mg/L。

本文就低濃度乙醇體系中的兩種體系，即低濃度乙醇-水溶液體系和低濃度乙醇-緩沖液（PBS）體系進行研究。低濃度乙醇-水溶液體系中無法得到工作曲線，說明不能在此體系中進行EC含量的檢測；而低濃度乙醇-緩沖液（PBS）體系中得到了工作曲線，且線性關系良好，說明在低濃度酒精飲料及發酵食品檢測EC時要將低濃度乙醇樣品置于緩沖液體系中再進行檢測。對于高濃度酒精類飲料或發酵食品，可以對其進行脫醇等前處理，或者萃取EC后進行酶抑制法的測定。乙醇是復雜有機體系中的一種，除了乙醇以外的有機溶劑對酶活的影響還有待繼續進行深入的研究，方可進一步完善酶抑制法在EC檢測上的應用。

2.4檢出限的確定

乙醇-緩沖液（PBS）體系中，酶抑制法檢測EC的檢出限如表4所示。

表4　乙醇-緩沖液體系中酶抑制法檢測氨基甲酸乙酯的檢出限Table 4　Detection limit of EC based on inhibition rate in ethanol-buffer

由表4可知，在5%、10%、15%乙醇-緩沖液（PBS）體系中，酶抑制法檢測EC的檢出限分別為0.00895、0.04259、0.02916mg/L。

2.5精密度的確定

乙醇-緩沖液（PBS）體系中，酶抑制法檢測氨基甲酸乙酯的精密度實驗結果如表5所示。

表5　乙醇-緩沖液體系中酶抑制法檢測氨基甲酸乙酯的精密度（%）Table 5　Precision（%）of ethyl carbamate based on inhibition rate in ethanol-buffer

由表5可知，在5%和10%的乙醇-緩沖液（PBS）體系中，RSD分別在1.41%～2.17%和0.34%～0.55%；在15%的乙醇-緩沖液（PBS）體系中，RSD在3.61%～6.44%之間。因此，5%和10%的乙醇-緩沖液（PBS）體系精密度良好，而15%的乙醇-緩沖液（PBS）體系精密度有所下降。所以酶抑制法可以在低濃度乙醇-緩沖液（PBS）體系中檢測EC的含量。

3　結論

3.1在乙醇-水溶液和乙醇-緩沖液（PBS）體系中，隨乙醇濃度的增加，乙酰膽堿酯酶的活力都不同程度的減小，且當乙醇濃度增加至20%時，酶活力已被抑制了88%左右。因此，酶抑制法用于檢測乙醇體系中的EC含量時，必須在低濃度乙醇體系中進行。

3.2在低濃度乙醇-水溶液體系中，無法得到EC的工作曲線。因此，在進行酒類及發酵類食品中EC含量的檢測時不能在低濃度乙醇-水溶液體系中，而應在低濃度乙醇-緩沖液（PBS）體系中進行。本研究得到在5%、10%和15%的乙醇-緩沖液（PBS）體系中測定EC的線性范圍分別為2～10、1～5、1～5mg/L，相關系數在0.992～0.997之間，RSD分別在1.41%～2.17%、0.34%～0.55%、3.61%～6.44%之間，最低檢出限分別為0.00895、0.04259、0.02916mg/L。

3.3該方法所用試劑成本低，方法快速簡單、條件溫和易于控制、所用設備少，易于操作。本研究有利于酒精飲料及發酵食品中的氨基甲酸乙酯檢測方法及產品的研究與開發。

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Determination of ethyl carbamate in ethanol system based on enzyme inhibition method

ZHANG Jia-jia1，LIU Li-bin1，LIU Zhi-jun1，HUANG Qiu-ting2，HUANG Hui-hua1，*
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Alcohol Testing Center of Guangzhou，Guangzhou 510160，China）

Acetylcholine was hydrolyzed by acetylcholinesterase in ethanol aqueous solution and ethanol-buffer respectively.The content of ethyl carbamate was determined and calculated，according to the linear relationship between ethyl carbamate and acetylcholinesterase activity.The results showed that this method was unfeasible in ethanolaqueous solution system.It was found that while there was a linear relationship between inhibition rate of acetylcholinesterase activity and concentration of ethyl carbamate in certain range in ethanolbuffer.At 5%，10%and 15%ethanol-buffer systems，the linear detection scales showed from 2～10，1～5，1～5mg/L respectively，with the correlation coefficients 0.997，0.992 and 0.995 respectively.The detection limit reached 0.00895，0.04259，0.02916mg/L respectively and RSD showed ranges from 1.41%～2.17%，0.34%～0.55%，3.61%～6.44%respectively.The method exhibited the merits not only in detection time，few use of instruments and equipment，but also in less cost.The study provided data and theoretical support for fast，simple and cheap methods and relative products of determining ethyl carbamate in alcohol beverages and fermented foods.

acetylcholinesterase；enzyme inhibition method；ethyl carbamate；ethanol

TS207.3

A

1002-0306（2015）02-0065-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.005

2014－05－23

張佳佳（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品工程。

黃惠華（1959-），男，博士研究生，教授，研究方向：農產品深加工與高值化利用。

廣州市科技計劃項目（201300000079）。