UPLC-MS/MS與HPLC測定茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥殘留的比較

仲伶俐，胡　莉，郭靈安，雷紹榮，毛建霏，付成平（四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066）

UPLC-MS/MS與HPLC測定茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥殘留的比較

仲伶俐，胡莉，郭靈安*，雷紹榮，毛建霏，付成平
（四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066）

比較了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）與高效液相色譜（HPLC）法測定茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥殘留的分析方法。樣品經乙腈提取，氨基固相萃取柱凈化，HPLC和UPLC-MS/MS測定。結果表明，在相同的前處理條件下，兩種方法均具有較好的準確度和精密度，UPLC-MS/MS法在0.01～0.1mg/kg添加水平下回收率為75.2%～115.6%，相對標準偏差（RSD）為4.4%～16.7%。HPLC法在0.05～1.0mg/kg添加水平下回收率為82.7%～120.7%，相對標準偏差（RSD）為0.8%～12.9%。UPLC-MS/MS法相對于HPLC法有更高的靈敏度，10種氨基甲酸酯類農藥在UPLC-MS/MS上檢出限為0.02～0.3μg/kg，HPLC法檢出限為3～7.5μg/kg；其高靈敏度和選擇性，使其更適于多農藥殘留同時檢測和微量殘留檢測。

超高效液相色譜-串聯質譜，高效液相色譜，茶葉，氨基甲酸酯

茶葉是我國出口的主要經濟作物之一。近年，茶葉中農藥殘留超標和使用違禁藥物的現象備受關注。衛生部食品污染源調查項目中，已經要求對茶葉中氨基甲酸酯類化合物污染情況進行檢測。早在2011年9月與12月，歐盟兩次出臺法規，強化對中國輸歐茶葉的口岸抽檢力度。此外，歐盟近年密集出臺茶葉農殘限量標準，使得輸歐茶葉市場準入資格日益嚴苛。歐盟對農殘標準的高要求，也導致了中國茶葉出口受到影響［1-2］。

氨基甲酸酯類農藥是繼有機氯、有機磷類農藥后發展較為迅速的一類高效、廣譜殺蟲劑，主要應用于糧食、蔬菜和水果上，近幾年在茶葉中的使用量和檢出率也逐年增加［3-7］。目前，有關氨基甲酸酯類農藥檢測的報道涉及水果、蔬菜、小麥、煙草、水、茶葉等基質。方法主要有酶聯免疫法、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜法（HPLC-MS）等［2-5，7-15］。其中，HPLC柱后衍生熒光檢測方法成熟，靈敏度高，應用較普遍。近年，LC-MS-MS分析技術以其很高的靈敏度和分離能力等優點而發展迅速，而茶葉基質復雜（含有多達數百種化學成分），其農藥殘留分析時雜質干擾嚴重。研究茶葉中農藥殘留已成為食品安全檢測技術研究的難點和熱點。

本研究對超高效液相色譜-串聯質譜法和液相色譜法測定茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥殘留進行了對比。旨在探尋相同的前處理條件下，兩種不同的檢測方法之間的差異性，以便在實際工作中合理選擇適用的方法，充分發揮各自的優點，提高工作效率。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

茶葉樣品峨眉山綠毛峰，四川省峨眉山市茶廠，2012年3月18日，一芽一葉，粉碎備用；10種氨基甲酸酯類農藥標準物質標準溶液，濃度1000μg/mL，農業部環境質量監督檢驗測試中心；甲醇、乙腈色譜純，美國SIGMA-ALDRICH；二氯甲烷色譜純，美國Honeywell Burdick&Jackson；氯化鈉分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司；氨基固相萃取柱6mL，500mg，美國Agilent Accubond NH2；實驗用水均為超純水；柱后衍生試劑套裝含OPA稀釋溶液cat.No CB910、0.05mol/L NaOH溶液cat.No CB130、OPA cat. No 0120、Thiofluor cat.No 370022000，美國Pickering公司。

Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯質譜儀、Waters e2695高效液相色譜儀配有2487熒光檢測器和柱后衍生裝置，美國Waters；R-210旋轉蒸發儀德國BUCHI；培英THZ-C恒溫振蕩器大倉市實驗設備廠；DT-1002A電子天平常熟市金羊砝碼儀器有限公司；微孔濾膜0.22μm，天津津騰實驗設備有限公司；ACD1-2005-U實驗室超純化水機艾科浦。

1.2實驗方法

本實驗采用相同的樣品前處理方法，進行UPLCMS/MS和HPLC兩種不同方法的測定。

1.2.1標準溶液配制吸取農藥標準溶液（濃度1000μg/mL）1mL于10mL刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成100μg/mL的農藥標準儲備溶液。移取各農藥標準儲備液0.1mL于10mL刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1.0μg/mL的混合標準工作溶液。上機標準使用液用前根據需要用甲醇-水（1∶1）稀釋成適當濃度。實驗中串聯質譜法均以基質標準溶液進行定量，基質標準使用液用陰性空白樣品溶液稀釋成適當濃度。

1.2.2樣品制備和提取稱取5g試樣（精確至0.01g）于磨口錐形瓶中，加入20mL水，渦旋，使茶葉充分潤濕，靜置溶脹20min，加入50mL乙腈提取液，置于振蕩器上振蕩1h，過濾，濾液收集到裝有約5g氯化鈉（氯化鈉用前于140℃烘烤4h）的50mL具塞量筒中，蓋上塞子，震搖1min，靜置2h。鹽析分層后吸取10mL上清液（乙腈相）于100mL梨形瓶中，40℃水浴旋轉蒸干，加入3.0mL淋洗液（甲醇+二氯甲烷=5+95）溶解殘渣，蓋上塞子待凈化。

1.2.3SPE凈化濃縮氨基SPE小柱用4mL淋洗液活化，棄去淋洗液，當液面快要到達SPE柱吸附層表面時，將待凈化樣品溶液轉移至SPE小柱中，收集流出液于50mL梨形瓶中，再用淋洗液洗滌裝樣液的梨形瓶三次（3+2+2mL），并轉至SPE小柱，合并淋洗液。淋洗液于30℃水浴旋轉蒸發至近干，洗耳球吹干，用甲醇-水（1∶1）定容至2.0mL，渦旋混勻，過0.22μm濾膜，待測。添加回收實驗前處理同空白樣品。即將標準物質添加到樣品，靜置半小時后以同樣的方法提取凈化。

1.2.4實驗條件

1.2.4.1高效液相色譜法色譜柱：waters carbamate（3.9mm×150mm，5μm）；柱溫：40℃；進樣量：20μL。流動相A：水，流動相B：甲醇；流速：0.8mL/min；梯度洗脫程序：0～2min，85%A；2～10min，85%～65%A；10～21min，65%～60%A；21～25min，60%～20%A；25～30min，20%～85%A；30～35min，85%A。

1.2.4.2超高效液相色譜-串聯質譜法色譜柱：Thermo C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱溫：40℃；進樣量：5μL。流動相A：水，流動相B：甲醇-乙腈=1∶1；流速：0.3mL/min；梯度洗脫程序：0～1min，80%A；1～3min，80%～50%A；3～4.2min，50%～20%A；4.2～5.2min，20% A；5.2～5.5min，20%～80%A；5.5～6.5min，80%A。離子源為電噴霧（ESI+），掃描方式為多反應監測（MRM），毛細管電壓：3.5kV，離子源溫度：150℃，脫溶劑氣（N2）溫度：350℃，脫溶劑氣流速：700L/h，錐孔氣流速：50L/h，碰撞氣流速（Ar）：2.2L/h。其他相關質譜參數見表1。

表1　10種氨基甲酸酯農藥質譜參數Table 1　UPLC-MS/MS parameters for 10 carbamate pesticides

2　結果與討論

2.1儀器條件的優化

2.1.1色譜條件的優化HPLC法檢測時對液相色譜分離要求較高，如殘殺威和克百威這兩個較難分離的組分，需要足夠的分析時間和合適的梯度條件才能達到基線分離（圖1）。而串聯質譜法對色譜分離的要求則不那么嚴格，即使沒有完全分離也不影響定量分析（圖2），這也是其同時分析多組分農殘的優勢所在。茶葉空白樣品和茶葉加標樣品的總離子流色譜圖見圖2、圖3，液相色譜圖見圖1、圖4。

圖1　HPLC測定茶葉加標（0.1mg/kg）樣品色譜圖Fig.1　Chromatography of tea sample spiked with a mixture of carbamate pesticide standards（0.1mg/kg）by HPLC

圖2　UPLC-MS/MS測定茶葉加標樣品（0.05mg/kg）總離子流色譜圖Fig.2　Total ion current chromatograms（TIC）of tea sample spiked with a mixture of carbamate pesticide standards（0.05mg/kg）by UPLC-MS/MS

2.1.2質譜參數的選擇氨基甲酸酯類化合物易離子化，適合采用ESI源。其含有的氨基甲?；?OCONHCH3是一個給電子基團，容易得到一個質子，故容易在正離子模式下得到更多的離子，獲得響應［17］。首先采用直接進樣方式，在ESI+模式下找到母離子，然后通過調節碰撞能量選擇2個相對豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子（見表1）。分析時再結合化合物保留時間等信息，進行定性、定量分析。從茶葉空白樣品和加標樣品總離子流色譜圖（圖2、圖3）中可以看出，在串聯四級桿多反應監測（MRM）模式下進行檢測，所選的定量離子和定性離子具有很高的特異性，各目標物質分析時均不存在干擾。

圖3　UPLC-MS/MS測定茶葉空白樣品總離子流色譜圖Fig.3　Total ion current chromatograms（TIC）of tea sample by UPLC-MS/MS

圖4　HPLC測定茶葉空白樣品液相色譜圖Fig.4　Chromatography of tea sample by HPLC

2.2基質效應的影響探討

液相色譜-串聯質譜檢測時普遍存在基質效應問題，當樣品中的共提取物與被測物一同進入質譜系統，將在一定程度上影響被測物的離子化過程，造成響應信號的抑制或提高［10，16］。本文將標準溶液峰響應設為100，則基質標準溶液峰響應=基質標準溶液峰面積/標準溶液峰面積×100，再將二者比較，從而直觀地顯示出基質效應的影響。結果顯示：串聯質譜法檢測時，有些農藥存在明顯的基質效應（如圖5所示），其中，涕滅威、異丙威、仲丁威在茶葉基質中的響應明顯增強，殘殺威、克百威、甲萘威則受到一定的抑制作用。而同樣的前處理條件下，液相色譜法基質效應并不明顯（如圖6所示），因此，在用串聯質譜法檢測時，必須配制基質標準溶液進行定量分析才能獲得準確的結果。

圖5　標準溶液和茶葉基質標準溶液峰響應比較（UPLC-MS/MS）Fig.5　Comparison of peak response between standard solution and standard solution in tea matrix（UPLC-MS/MS）

圖6　標準溶液和茶葉基質標準溶液峰響應比較（HPLC）Fig.6　Comparison of peak response between standard solution and standard solution in tea matrix（HPLC）

2.3方法檢出限、定量限、回收率與精密度

乙腈對氨基甲酸酯類農藥具有較好的溶解性，對樣品也具有較強的滲透性，并且能夠通過鹽析達到農藥在乙腈中的最大提取效率，確保回收。提取前加入足夠量的水分使之充分潤濕，并放置一段時間，再加入乙腈，有助于茶葉中農藥尤其是極性較大農藥的提?。?6］，將提取溶劑體積確定為樣品質量的10倍能夠保證提取充分。實驗對茶葉空白樣品進行10種氨基甲酸酯類農藥的4水平添加實驗，添加濃度分別為0.01、0.05、0.1和1.0mg/kg，每個添加水平做3個平行。根據儀器靈敏度和添加回收實驗，分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法檢出限和定量限。10種氨基甲酸酯類農藥的相關系數（r2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）見表2。經標準曲線測試，UPLC-MSMS法在0.01～0.1mg/kg范圍內線性關系良好，相關系數（r2）為0.9902～0.9998，檢出限為0.02～0.3μg/kg，定量限為0.07～1μg/kg；HPLC法在0.05～1.0mg/kg范圍內線性關系良好，相關系數（r2）為0.9995～0.9998，檢出限為3～7.5μg/kg，定量限為10～25μg/kg。

表2　10種氨基甲酸酯類農藥的相關系數（r2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2　Correlation coefficients（r2）、LOD and LOQ of 10 carbamates

茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥的添加回收率與精密度見表3。UPLC-MS-MS進行0.01、0.05和0.1mg/kg添加水平的測定，加標回收率為75.2%～115.6%，相對標準偏差（RSD）為4.4%～16.7%。HPLC進行0.05、0.1和1.0mg/kg添加水平的測定，加標回收率為82.7%～120.7%，相對標準偏差（RSD）為0.8%～12.9%。結果表明，液相色譜-串聯質譜法和液相色譜法在其添加范圍內均能獲得較好的準確度和精密度。經氨基SPE小柱凈化后，液相色譜-串聯質譜法無雜質干擾，而液相色譜法檢測時，異丙威與雜質峰未達到基線分離，給色譜峰積分、定量帶來一定困難（如圖1所示）。

3　結論

經過比較，在相同的前處理條件下，用液相色譜-串聯質譜法和液相色譜法測定茶葉中氨基甲酸酯類農藥殘留，均具有較好的準確度和精密度，UPLCMS-MS法3水平的加標回收率為75.2%～115.6%，相對標準偏差（RSD）為4.4%～16.7%。HPLC法3水平的加標回收率為82.7%～120.7%，相對標準偏差（RSD）為0.8%～12.9%。液相色譜-串聯質譜法相對于液相色譜法有更高的靈敏度，10種氨基甲酸酯類農藥在UPLC-MS-MS上檢出限能夠達到0.02～0.3μg/kg，HPLC法檢出限僅為3～7.5μg/kg。其高靈敏度和選擇性，使其更適于多農藥殘留同時檢測和微量殘留檢測。但需要注意的是，茶葉基質復雜，液相色譜-串聯質譜法檢測時基質效應明顯，必須用基質標準溶液進行定量分析，以保證結果的準確性和可靠性。

表3　茶葉中10種氨基甲酸酯類農藥的添加回收率與精密度（n=3，%）Table 3　Recoveries and precisions of 10 carbamates in tea samples at three spiked levels（n=3，%）

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Comparison of UPLC-MS/MS and HPLC for determination of 10 carbamate pesticide residues of tea

ZHONG Ling-li，HU Li，GUO Ling-an*，LEI Shao-rong，MAO Jian-fei，FU Cheng-ping（Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

The ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）and high performance liquid chromatography（HPLC）for determination of 10 carbamate pesticide residues of tea were compared.The samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up by amino solid-phase extraction column，then determined by HPLC and UPLC-MS/MS.The results showed that，both methods had good accuracy and precision.The recoveries ranged 75.2%～115.6%by UPLC-MS/MS when spiked levels 0.01～0.1mg/kg，with the relative standard deviations 4.4%～16.7%.The recoveries ranged 82.7%～120.7%by HPLC when spiked levels 0.05～1.0mg/kg，with the relative standard deviations 0.8%～12.9%.UPLC-MS/MS had higher sensitivity，compared to HPLC，LOD of 10 carbamate pesticides on UPLC-MS/MS was 0.02～0.3μg/kg，which on HPLC was 3～7.5μg/kg.UPLC-MS/MS was more suitable for detection of multiple pesticide residues and trace pesticides because its high sensitivity and selectivity.

UPLC-MS/MS；HPLC；tea；carbamate

TS207.3

A

1002-0306（2015）02-0070-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.006

2014－03－11

仲伶俐（1982-），女，碩士研究生，助理研究員，研究方向：食品檢測與分析。

郭靈安（1962-），男，本科，副研究員，研究方向：食品質量安全。