康磚茶中兒茶素、咖啡因、沒食子酸HPLC-DAD分析

李建華，齊桂年，陳盛相，朱明珠（.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川雅安62504；2.四川省茶葉產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，四川名山62500）

康磚茶中兒茶素、咖啡因、沒食子酸HPLC-DAD分析

李建華1，2，齊桂年1，*，陳盛相1，朱明珠1
（1.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川雅安625014；2.四川省茶葉產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，四川名山625100）

采用二極管陣列檢測器（DAD）和AcclaimTM120色譜柱，建立了一種簡單、靈敏分析茶葉中兒茶素、咖啡因（CAF）、沒食子酸（GA）的高效液相色譜法。色譜條件：流動相為KH2PO4-乙腈系統(tǒng)，梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，檢測器波長為278nm。結(jié)果表明，6種兒茶素、咖啡因、沒食子酸在一定范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)為0.9991～0.9998，具有較低的日內(nèi)和日間偏差，平均加標回收率在92.49%～106.08%之間，RSD小于3.59%。應用該方法對康磚茶進行分析，其GA、EGC、CAF、C、EC、EGCG、EGCG3"Me、ECG含量分別在0.0717%～1.115%、0.280%～0.660%、2.728%～4.621%、0～0.0882%、0.157%～1.238%、0.343%～7.176%、0～0.172%及0.108%～1.654%。

康磚茶，兒茶素，咖啡因，沒食子酸，HPLC-DAD

茶葉中含有許多天然多酚類物質(zhì)，兒茶素約占70%以上，其主要由（-）-表兒茶素（EC），（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG），（-）-表沒食子兒茶素（EGC）和（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）組成。這些兒茶素涉及多種生物活性，如抗氧化、抗癌、抗微生物、抗病毒和抗動脈粥樣硬化［1-6］。另有報道稱，在兒茶素的異構(gòu)體中可能與主要兒茶素一樣具有活性或活性更強［7-9］，其中，主要存在于少數(shù)烏龍茶和綠茶中的（-）-表沒食子兒茶素-3-O（3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3"Me）［10-11］，已被證明具有很強的抗過敏作用［9，12-14］。而分析茶葉中兒茶素的主要方法是高效液相色譜法（HPLC），但目前報道的方法很少用來分析甲基化兒茶素及同時測定茶葉中兒茶素與甲基化兒茶素或使用電化學檢測器［15-17］。

四川黑茶起源于十一世紀前后，主要分為南路邊茶和西路邊茶，其中南路邊茶分為康磚、金尖兩個花色，主產(chǎn)于雅安，專銷西康和西藏地區(qū)［18］。盡管康磚茶已有上千年的生產(chǎn)歷史，但對康磚茶中兒茶素組分的報道很少，更未見對其甲基化兒茶素進行研究。因此，本研究旨在建立一種同時測定康磚茶中5種常見兒茶素（EGC，C，EC，EGCG，ECG），1種甲基化兒茶素（EGCG3"Me），咖啡堿（CAF）和沒食子酸（GA）8種成分的HPLC-DAD法，以期為四川黑茶的品質(zhì)質(zhì)量檢測與綜合效益的發(fā)揮、開發(fā)新型功能茶和茶葉天然抗過敏藥物都具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沒食子酸、咖啡堿、C、EC、EGC、EGCG、ECG標液Sigma公司；EGCG3"Me標液和日本benifuji綠茶由湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室提供；康磚茶由四川省雅安市主要邊茶茶廠提供。

戴安3000高壓高效液相色譜儀美國Dionex UltiMate；Velocity18R離心機日本島津；AriumComfort純水機德國賽多利斯股份公司；DGP-3600SD泵，WPS-3000自動進樣器、TCC-3000柱溫箱，DAD-3000檢測器，AcclaimTM120（5μm，120?，4.6mm×250mm）C18色譜柱，通過Chromeleon?7色譜工作站控制并進行數(shù)據(jù)處理。

1.2樣品提取

準確稱取干燥的茶葉粉末150mg，加入50%乙腈（V/V）25mL、30℃、120r/min黑暗下浸提40min，之后8000r/min 4℃離心15min，上清液經(jīng)適當稀釋后，0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3色譜條件

1.3.1流動相采用6組流動相進行選擇，1#：0.2%乙酸水溶液-乙腈；2#：2%冰乙酸-乙腈；3#：KH2PO4緩沖液（0.02mol/L，pH2.5）-乙腈；4#：H2O-乙腈-H3PO4（400∶10∶1）-甲醇溶液（1∶2）；5#：A為9%乙腈-2%乙酸-20μg/mL EDTA溶液，B為80%乙腈-2%乙酸-20μg/mL EDTA溶液；6#：NaH2PO4溶液緩沖液（0.1mol/L，pH2.5）-乙腈。

1.3.2梯度洗脫條件8%的B相起始，0～5min保持8%的B相不變，5～25min B相從8%線性增加到11%，25～50min B相從11%線性增加到21%，50～51min B相增加至95%，51～54min保持B相95%不變，54～55min B相從95%降至8%，56～60min保持B相8%。流速：1.0mL/min；進樣量10μL。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相組成的優(yōu)化以6種不同的流動相對茶葉中EGCG3"Me等成分進行分離。結(jié)果表明：流動相不同，分離效果相差很大。采用1#流動相出現(xiàn)了CAF和C兩個峰的重疊，而2#、5#流動相出現(xiàn)了EC和EGCG的重疊，4#流動相分離效果最差，只分離出GA，這四種流動相中總有個別兒茶素分離不開或出現(xiàn)峰重疊。而3#流動相KH2PO4緩沖液（0.02mol/L，pH2.5）-乙腈和6#流動相NaH2PO4溶液緩沖液（0.1mol/L，pH2.5）-乙腈分離的選擇性和分離度最佳，但考慮到高濃度鹽易在管路產(chǎn)生結(jié)晶且對色譜柱傷害較大，故選擇3#流動相。

2.1.2柱溫隨著柱溫的降低，峰的保留時間tR都在推遲。在30℃下，咖啡堿和C兩個峰有部分的重疊。同樣，在20℃下，EC和CAF也出現(xiàn)了類似的情況。而在25℃下，EGC、EGCG、EGCG3"Me等8個目標峰清晰可見，分離效果最佳。

2.1.3檢測波長經(jīng)過210～290nm范圍的全波長光譜掃描發(fā)現(xiàn)，所有物質(zhì)在278nm左右均有明顯的吸收峰。GA、CAF、EGC、EGCG、EGCG3"Me在278nm下有最大吸收，而C、EC、ECG在280nm下有最大吸收。但C、EC、ECG在278nm和280nm下吸收值差異不顯著。光譜確定的各個物質(zhì)的最大吸收峰與色譜的一致。因此，278nm為最佳吸收波長。

2.1.4色譜峰的定性對目標物質(zhì)色譜峰的定性，主要根據(jù)標準對照品的保留時間及對應的紫外光譜圖進行對照定性，如果兩者的吸收光譜特征完全相同，可認定兩者是同一種化合物。GA、EGC、CAF、C、EC、EGCG、EGCG3"Me、ECG的最大吸收波長分別為：273.5、271.3、275.3、281.2、280.5、276.6、278.6、279.3nm。C的最大吸收波長大于EC，這是因為化合物的立體位阻造成反式異構(gòu)體的最大吸收波長比順式異構(gòu)體大，位阻影響了共軛體系的共平面性質(zhì)。甲基化EGCG的最大吸收波長也比EGCG的大。

2.2HPLC法測定茶葉中兒茶素的含量

2.2.1HPLC法分離和檢測茶葉中的兒茶素兒茶素、沒食子酸和咖啡堿混標HPLC色譜圖見圖1。從圖1中可知，混標的出峰順序為：GA，5.9min；EGC，21.1min；CAF，23.2min；C，24.5min；EC，36.4min；EGCG，37.8min；EGCG3"Me，46.7min；ECG，50.5min。簡單兒茶素EGC、C比酯型兒茶素EGCG、EGCG3"Me和ECG先出峰，異構(gòu)體C比表兒茶素EC先出峰。同時，按照本實驗建立的樣品處理方法對日本benifuji綠茶進行了測定（其色譜圖見圖2），EGCG3"Me的含量高達1.656%。從色譜圖上可知，各種成分都能夠達到基線分離的效果。

圖1　混標HPLC色譜圖Fig.1　Elution profiles of mixed authentic standards

圖2　benifuji綠茶的HPLC色譜圖Fig.2　Elution profiles of benifuji green tea

2.2.2方法的標準曲線、檢測限與線性范圍參照ISO 14502-2，稱取各標準物質(zhì)，用穩(wěn)定溶液溶解后并定容作為標準儲備液，將儲備液進行稀釋配成不同質(zhì)量濃度的EGC、EGCG、EC、ECG等的混合標準溶液，每個濃度點測定三次，取平均值。以各組分濃度X（mg/L）為橫坐標，色譜峰峰面積Y（mAU·min）為縱坐標作圖，由表1可知，所有標液曲線方程的R2＞0.999。LOD的計算是通過將每個標準溶液逐步稀釋，當信噪比（S/N=3）時的濃度即為最低檢出限。大多數(shù)標液的檢出限在0.2～3.0ng之間。EGC具有最高的檢測限為9.12ng，其次是C為3.68ng，GA檢測限最低，為0.26ng（表1）。

表1　方法的標準曲線、檢出限與線性范圍Table 1　Standard curves，limit of detection，and linear range of HPLC-DAD method

2.2.3方法的重復性、穩(wěn)定性和回收率方法的重復性是取同一質(zhì)量濃度各標準溶液在同1d連續(xù)進樣6次以考察方法精密度，測定其保留時間和峰面積的相對標準偏差。結(jié)果表明，大多數(shù)標液的保留時間和峰面積RSD（%）＜1%（見表2），方法的重復性好。

表2　HPLC-DAD方法的重復性、穩(wěn)定性和回收率Table 2　Repeatability，reproducibility，and recovery of HPLC-DAD method

日內(nèi)精密度是在同一天連續(xù)5次測定同一樣品，日間精密度是同一樣品連續(xù)3d測定，每天測定3次，取平均值。結(jié)果表明，日內(nèi)和日間精密度的RSD大多在6%以下，所有樣品組分測定結(jié)果表明日內(nèi)精密度的RSD（%）均小于日間精密度的RSD（%）（見表2），這與Bing Hu等研究結(jié)果（即方法的日內(nèi)精密度小于日間精密度）相一致［10］。沒食子酸，6種兒茶素和咖啡堿都具有較低的日內(nèi)和日間偏差，表明方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。

回收率是取已知含量的樣品，加入不同濃度的對照品3次，處理樣品后進行測定，計算各組分的回收率。結(jié)果表明回收率在92.49%～106.08%之間，RSD小于3.59%（見表2）。

2.3HPLC法在四川康磚茶檢測中的應用

康磚茶的HPLC色譜圖見圖3，兒茶素及甲基化兒茶素的含量見表3。結(jié)果表明，部分康磚中含有EGCG3" Me，含量在0～0.172%之間，含量最高的是康磚1，只有康磚4中不含甲基化兒茶素。EGC、EC、EGCG、ECG含量最高的是康磚1，含量分別為0.660%、1.238%、7.176%、1.654%。CAF含量最高的是康磚2，含量高達4.621%。C、GA在康磚5含量最高，GA含量高達1.115%。

圖3　康磚1的HPLC圖Fig.3　Elution profiles of kangzhuan tea1

表3　康磚中兒茶素、咖啡因、沒食子酸的含量（%）Table 3　Content of catechins，caffeine，gallic acid in Kangzhuan tea（%）

3　結(jié)論與討論

本實驗采用DAD和AcclaimTM120（5μm，120?，4.6mm×250mm）色譜柱，建立了一種同時檢測四川黑茶康磚茶中5種常見兒茶素、1種甲基化兒茶素（EGCG3"Me），咖啡堿和沒食子酸的高效液相色譜法，本方法簡單易行，重復性好、穩(wěn)定性強、回收率高。同時，還發(fā)現(xiàn)了部分康磚茶中含有EGCG3"Me，但其含量相對于不發(fā)酵日本benifuji綠茶EGCG3"Me含量（1.656%）比較低，這主要由于黑茶是發(fā)酵茶，大部分的兒茶素（EGCG3"Me）隨著加工過程而被微生物酶作用下氧化聚合破壞［10］。

［1］Fraga C G.Plant polyphenols：how to translate their in vitro antioxidant actions to in vivo conditions［J］.IUBMB Life，2007，59（4-5）：308-315.

［2］Song J M，Lee K H，Seong B L.Antiviral effect of catechins in green tea on influenza virus［J］.Antiviral research，2005，68（2）：66-74.

［3］Bettuzzi S，Brausi M，Rizzi F，et al.Chemoprevention of human prostate cancer by oral administration of green tea catechins in volunteers with high-grade prostate intraepithelial neoplasia：a preliminary report from a one-year proof-of-principle study［J］. Cancer Research，2006，66（2）：1234-1240.

［4］Kim S H，Park H J，Lee C M，et al.Epigallocatechin-3-gallate protects toluene diisocyanate-induced airway inflammation in a murinemodelofasthma［J］.FEBSLetters，2006，580（7）：1883-1890.

［5］Pasten C，Olave N C，Zhou L H，et al.Polyphenols downregulate PAI-1 gene expression in cultured human coronary artery endothelialcells：Molecularcontributortocardiovascular protection［J］.Thrombosis Research，2007，121（1）59-65.

［6］Dai J，Mumper R J.Plant phenolics：extraction，analysis and their antioxidant and anticancer properties［J］.Molecules，2010，15（10）：7313-7352.

［7］Ikeda I，Kobayashi M，Hamada T，et al.Heat-epimerized tea catechins rich in gallocatechin gallate and catechin gallate are more effective to inhibit cholesterol absorption than tea catechins rich in epigallocatechin gallate and epicatechin gallate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（25）：7303-7307.

［8］Oritani Y，Setoguchi Y，Ito R，et al.Comparison of（-）-Epigallocatechin-3-O-gallate（EGCG）and O-Methyl EGCG Bioavailability in Rats［J］.Biological&Pharmaceutical Bulletin，2012，36（10）：1577-1582.

［9］Maeda-Yamamoto M，Ema K，Monobe M，et al.Epicatechin-3-O-（3″-O-methyl）-gallate content in various tea cultivars（Camellia sinensis L.）and its in vitro inhibitory effect on histamine release［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（9）：2165-2170.

［10］Hu B，Wang L，Zhou B，et al.Efficient procedure for isolating methylated catechins from green tea and effective simultaneous analysis of ten catechins，three purine alkaloids，and gallic acid in tea by high-performance liquid chromatography with diode array detection［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216（15）：3223-3231.

［11］Chiu F L，Lin J K.HPLC analysis of naturally occurring methylated catechins，3″-and 4″-methyl-epigallocatechin gallate，in various fresh tea leaves and commercial teas and their potent inhibitory effects on inducible nitric oxide synthase in macrophages［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（18）：7035-7042.

［12］Maeda-Yamamoto M，Tachibana H.Anti-Allergic Action of O-methylated EGCG in Green Tea Cultivar Benifuuki［J］.Journal of Food&Drug Analysis，2012，20：313-317.

［13］Maeda-Yamamoto M，Ema K，Shibuichi I.In vitro and in vivo anti-allergic effects of‘benifuuki’green tea containing O-methylatedcatechinandgingerextractenhancement［J］. Cytotechnology，2007，55（2-3）：135-142.

［14］Tantoush Z，Apostolovic D，Kravic B，et al.Green tea catechins of food supplements facilitate pepsin digestion of major food allergens，but hampers their digestion if oxidized by phenol oxidase［J］.Journal of Functional Foods，2012，4（3）：650-660.

［15］Sano M，Tabata M，Suzuki M，et al.Simultaneous determination of twelve tea catechins by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.Analyst，2001，126（6）：816-820.

［16］Haginaka J，Tabo H，Ichitani M，et al.Uniformly-sized，molecularly imprinted polymers for（-）-epigallocatechin gallate，-epicatechin gallate and-gallocatechin gallate by multi-step swelling and polymerization method［J］.Journal of ChromatographyA，2007，1156（1）：45-50.

［17］Kerio L C，Wachira F N，Wanyoko J K，et al.Total polyphenols，catechin profiles and antioxidant activity of tea products from purple leaf coloured tea cultivars［J］.Food Chemistry，2013，136：1405-1413.

［18］陳椽.制茶學［M］.第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1989：6-7.

Analysis of catechin，caffeine and gallic acid in Kangzhuan tea by HPLC-DAD

LI Jian-hua1，2，QI Gui-nian1，*，CHEN Sheng-xiang1，ZHU Ming-zhu1
（1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.The Quality Examination Center of Sichuan Tea，Mingshan 625100，China）

A High-performance Liquid Chromatographyhigh method with a diode array detector（DAD）and AcclaimTM120 as column，was established for simultaneous analysis of tea catechins，caffeine（CAF），and gallic acid（GA）.Its chromatographic conditions were as follows：mobile phase of KH2PO4and acetonitrile，gradient elution，flow rate of 1.0mL/min，temperature of column 25℃，sample amount 10μL，Detector wavelength 278nm. The results showed that six kinds of catechins，caffeine，gallic acid were in a range of good linearity correlation coefficient of 0.9991 to 0.9998，with low intra-and inter deviation，the average recovery between 92.49%～106.08%，and the relative standard deviation（RSD）of less than 3.59%.Futhermore，This method was applied to analyze Kangzhuan tea，its GA，EGC，CAF，C，EC，EGCG，EGCG3"Me，ECG contents were between 0.0717%～1.115%，0.280%～0.660%，2.728%～4.621%，0～0.0882%，0.157%～1.238%，0.343%～7.176%，0～0.172%and 0.108%～1.654%，respectively.

Kangzhuan tea；catechin；caffeine；gallic acid；HPLC-DAD

TS272.7

A

1002-0306（2015）02-0075-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.007

2014-05-12

李建華（1984-），女，在讀博士研究生，研究方向：茶葉加工理論與技術(shù)。

齊桂年（1956-），男，博士研究生，教授，研究方向：茶葉精深加工。

四川省科技成果轉(zhuǎn)化重點項目（12CGZHZX0579）；四川省科技支撐計劃項目（14ZC1700）。